Baixe Comparação de Testes Sorológicos em Cães para Detecção de Leishmania: ELISA, IFI e WB e outras Notas de aula em PDF para Diagnóstico, somente na Docsity!
Ciência Animal Brasileira v. 6, n. 1, p. 41-47, jan./mar. 2005 4 1
A UTILIZAÇÃO DA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA NO DIAGNÓSTICO
DE ROTINA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA E SUAS IMPLICAÇÕES
NO CONTROLE DA DOENÇA
LÍDIA S ILVA DE OLIVEIRA ¹, F RED DA SILVA J ULIÃO ², V ERENA MARIA M ENDES DE S OUZA ², D ANIELA S OUZA
FREITAS¹, BÁRBARA M ARIA P ARANÁ DA S ILVA S OUZA ¹, B RUNO J EAN A DRIEN P AULE ³, P AULO H ENRIQUE
PALIS A GUIAR^4 , S TELLA M ARIA BARROUIN M ELO^4 E CARLOS ROBERTO F RANKE 5
- Graduanda da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (EMV/UFBA, Bahia, BA.
- Aluno do curso de Mestrado em Medicina Veterinária Tropical da EMV/UFBA.
- Doutorando do Instituto de Ciências da Saúde – UFBA.
- Professores Assistentes do Departamento de Patologia e Clínicas da EMV/UFBA.
- Professor Adjunto de Departamento de Produção Animal da EMV/UFBA.
RESUMO
Neste trabalho foram analisados, por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) e imunofluorescência indireta (IFI), 101 soros caninos provenientes da Região Metropolitana de Salvador, Bahia, sendo 30 soros de cães com resultado parasitológico positivo para Leishmania chagasi em cultura esplênica e 71 soros de cães clini- camente sadios. Dez soros de cães com cultivo positivo e com resultados sorológicos concordantes ou não entre os testes ELISA e IFI foram testados pela técnica de Western- Blotting (WB). Das 30 amostras de soro com resultado positivo em cultura, o ELISA detectou 27 amostras positivas
e o IFI mostrou resultado positivo em 12. Das 71 amostras de soro de cães clinicamente sadios, todas apresentaram resultados negativos no ELISA e uma apresentou resultado positivo no IFI. A sensibilidade e a especificidade foram de 90% e 100% para o ELISA e 40% e 98,6% para IFI, respectivamente. O índice de concordância Kappa entre os testes foi considerado moderado (0,53), e os resultados do WB apresentaram maior concordância com o ELISA. Este estudo demonstra a possibilidade de falha no teste IFI na detecção de cães infectados e discute a sua implicação no controle da doença em áreas endêmicas. PALAVRAS-CHAVE: Cães, ELISA, IFI, Leishmania chagasi , Western-Blotting.
ABSTRACT
THE USE OF INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCEASSAYAS ROUTINE DIAGNOSIS METHOD FOR VISCERAL CANINE LEISHMANIASIS AND ITS IMPLICATIONS IN DISEASE CONTROL
In this study, 101 canine sera from the Metropolitan Area of Salvador, Bahia were tested by indirect enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescence assay (IFA) for Leishmania reacting immunoglobulins. Thirty sera came from dogs living in an endemic area, with positive splenic culture for Leishmania chagasi and were used as positive standard. The other 71 sera came from healthy dogs, domiciliated in a non-endemic area. From the thirty dogs with positive culture, 27 were seropositive by ELISA and 12 by IFA. All 71 sera of healthy dogs were negative by ELISA and one had a positive result
by IFA. The sensitivity and specificity of ELISA were 90% and 100% and of IFI were 40% and 98,6%. The observed concordance index Kappa among the tests was moderated (0,53). Sera from ten positive culture dogs, concordant or discordant among the serotests were analysed by Western blotting, whose results gave better agreement with ELISA. These results evidenced a potential low sensitivity of IFA in detecting infected dogs with L. chagasi and its implications on the visceral leishmaniasis control in endemic areas are commented.
KEY WORDS: Dogs, ELISA, IFA, Leishmania chagasi , Western-Blotting.
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INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose importante pela morbimortalidade a ela associada e em virtude da sua rápida expansão geográfica registrada nas últimas décadas, resultando no estabelecimento de novas áreas endêmicas, a exemplo do demonstrado nos estados da Bahia (FRANKE et al., 2002a) e Maranhão (MENDES et al., 2002) situados na Região Nordeste do Brasil. As medidas de controle da LV preconizadas pela Organização Mundial de Saúde constam do diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos, e do controle dos vetores e realização de inquéritos sorológicos nas populações caninas seguidos da eliminação dos animais soropositivos (WHO, 1988). Nos últimos anos, alguns autores têm observado que a eliminação de cães soropositivos não tem contribuído significativamente para a redução da incidência da doença na população humana (RACHAMIM et al., 1991; EVANS et al., 1992; DYE, 1996; PARANHOS-SILVA et al., 1998). Uma das explicações possíveis para a reduzida eficiência da eliminação de cães soropositivos na redução da incidência de casos humanos seria a baixa sensibilidade do teste de imunofluorescência indireto (IFI) utilizado oficialmente nos inquéritos sorológicos caninos para controle da leishmaniose visceral no território brasileiro (BERRAHAL et al., 1996). A detecção apenas parcial dos casos caninos em uma determinada região resultaria na permanência de cães infectados, contribuindo para a continuidade do ciclo de transmissão do parasito nas populações caninas e humanas locais (COURTENAY et al., 2002). Outros testes sorológicos, tais como ELISA, DOT- ELISA ou Western-Blotting (WB), para a detecção de anticorpos antileishmania foram descritos na literatura (RACHAMIM et al., 1991; DIETZE et al., 1995; MANCIATI et al., 1996; BADARÓ et al., 1996; VERCAMMEN et al., 1997). Comparativamente ao teste de IFI, o teste ELISA tem várias vantagens, como um procedimento mais simples e rápido, necessita apenas uma diluição de soro e é considerado mais sensível (PARANHOS-SILVA et al., 1996; CABRAL et al., 1998). A característica do teste WB de reconhecer antígenos específicos do parasito o torna mais
específico e sensível que o IFI e o ELISA (BERRAHAL et al., 1996). Este trabalho teve como objetivo analisar amostras de soros caninos provenientes da Região Metropolitana de Salvador, avaliando comparativamente a capacidade diagnóstica dos testes de Imunofluorescência Indireta, ELISA e Western-Blotting.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram analisados, pelos testes ELISA e IFI, 101 soros caninos provenientes da Região Metro- politana de Salvador (RMS), Bahia, sendo 30 amos- tras de soros obtidas de cães comprovadamente positivos em cultivo esplênico para L. chagasi e 71 de cães clinicamente sadios. Os soros dos cães po- sitivos foram obtidos em inquérito domiciliar na ci- dade de Camaçari, RMS. Os 71 soros de cães sa- dios foram oriundos do canil do Hospital de Medi- cina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (18), de clínicas veterinárias particulares de Salva- dor (20) e de campanhas de vacinação realizadas na cidade de Salvador (28). Dez soros de cães com cultivo positivo e com resultados sorológicos con- cordantes ou não entre os testes ELISA e IFI fo- ram testados pela técnica de Western-Blotting (WB).
Preparação do antígeno ( Leishmania chagasi isolada de cão) para ELISA e Western-Blotting
A L. chagasi foi isolada pela inoculação de tecido esplênico canino em meio de cultivo com- posto por 5ml de ágar sangue (Blood Agar Base – Sigma, USA) com 5% de sangue de carneiro desfibrinado estéril e 3ml de meio Schneider (Sigma, USA), contendo 20% de soro fetal bovino e 50ìg/ ml de gentamicina. Os parasitos isolados foram posteriormente inoculados por via intraperitoneal em três hamsters. Após a apresentação dos sinais clínicos de leishmaniose, os hamsters foram necropsiados, e o macerado de baço e fígado foi colocado em 1 ml de meio Schneider e posteriormente transferido para uma garrafa de cultivo contendo este mesmo meio.
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DISCUSSÃO
A leishmaniose visceral vem apresentando uma clara tendência de expansão geográfica nas últimas décadas como foi demonstrado por FRANKE et al. (2002a), na Bahia, e MENDES et al. (2002), no Maranhão, e sua reemergência tem sido observada em várias regiões (ARIAS et al., 1996; SILVA et al., 2001). Fatores como fenômenos climáticos, implantação de projetos agroindustriais, rápido crescimento das cidades agravado pela falta de planejamento urbano, impactos ambientais e uma progressiva deteriorização da condição socioeconômica de ampla parcela das populações
urbanas têm sido citados como responsáveis pela expansão e reemergência da LV em vários países (DESJEUX, 1996; FRANKE et al., 2002b). Dentre as medidas de controle preconizadas pela Organização Mundial de Saúde, a realização de inquéritos sorológicos na população canina de áreas endêmicas, seguidos da eliminação dos cães infectados, tem apresentado resultados discordantes quanto a sua eficiência em reduzir a incidência de casos humanos da LV (TESH, 1995; DIETZE et al., 1997; ASHFORD et al., 1998; PALATNIK- DE-SOUSA et al., 2001). Dentre as causas desta discordância, especial atenção recai sobre a sensibilidade do teste diagnóstico utilizado nos
sentou resultado positivo no IFI. A sensibilidade e a especificidade foram de 90% e 100% para o ELISA e 40% e 98,6% para IFI, respectivamente. Os valo- res preditivos positivos e negativos foram de 100% e 95,9% para o ELISA e 92,3% e 79,5% para o teste IFI. O índice de concordância Kappa entre os tes- tes foi considerado moderado (0,53). Os resultados comparativos das amostras testadas pelo WB, ELISA e IFI estão apresentados na Tabela 2. O WB apresenta melhor concordância com os resultados do ELISA nas dez amostras analisadas, sendo que, dos nove soros de cães ELISA positivo, oito foram considerados WB positivo, ao passo que três soros negativos por IFI e positivos por ELISA foram con- firmados positivos por WB. A técnica de WB de- tectou no conjunto das doze amostras analisadas
TABELA 2. Resultados sorológicos comparativos de cães com cultura positiva.
Animais IFI ELISA WB
I - - - J - + + K - + + L - + + O + + + P + + + Q + + + R + + + S + + - T + + +
aproximadamente quinze bandas imunorreativas, sendo as bandas de 14, 16, 30, 32, 54, 62, 68 e 72 kDA consideradas imunodominantes (Tabela 3).
TABELA 3. Percentagem de reatividade de bandas reconhecidas por soros de cães considerados positivos por Western Blotting.
Peso J K L M N O P Q R S T % de reco- (kDa) nhecimento
14 + + + - + + + + + - + 82 16 + + + - + + + + + - + 82 28 + + - + - + + - - + + 64 30 + + + + + + - + + - + 82 32 + + + + + + - - + - + 73 54 + + + + + - + + + + + 91 62 + + + + + + + - + - + 82 68 + + + + + + - - + - + 73 72 + + + + + + + + + + + 100 122 + - - + - + - + - - + 45
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inquéritos sorológicos e a eficiência na retirada dos cães infectados das áreas endêmicas, fatores que contribuem para a permanência de cães infectados na área, viabilizando a continuidade do ciclo de transmissão do parasito nas populações caninas e humanas (COURTENAY et al., 2002). A sensibilidade do teste IFI obtido em nosso estudo comparativo com o ELISA foi considerada muito baixa, ficando aquém do que normalmente é citado na literatura (PARANHOS-SILVA et al., 1996; CABRAL et al., 1998), e discordando de alguns autores que afirmam a semelhança de desempenho destes dois testes (MANCIANTI et al., 1995; SCALONE et al., 2002; VERCAMMEN et al., 2002). No entanto, os dados sobre o desempenho do IFI disponíveis na literatura normalmente foram obtidos em laboratórios de pesquisa e referem-se a um número reduzido de amostras de soro canino examinadas. Essas condições ideais de execução da técnica nem sempre podem ser reproduzidas na rotina dos laboratórios da rede pública de saúde, em virtude do fornecimento irregular de materiais de consumo, da dificuldade na realização da técnica em laboratórios muitas vezes inadequados e da subjetividade na interpretação dos resultados do IFI, freqüentemente agravada pela urgência no processamento de um número elevado de amostras coletadas durante os inquéritos sorológicos caninos nas áreas endêmicas. Os resultados de ELISA e WB são concordantes e confirmam a baixa sensibilidade do IFI neste estudo. Esta concordância era previsível em virtude de os dois testes terem sido realizados num mesmo laboratório e com o mesmo antígeno. As bandas imunorreativas detectadas pelo WB em nosso estudo corroboram com algumas previamente descritas: 14 e 16 kDa (BERRAHAL et al., 1996), 30 e 68 kDa (VERCAMMEN et al., 2002), 32 e aproximadamente 120 kDa (MANCIANTI et al., 1995).
CONCLUSÕES
Neste trabalho foi demonstrado que o teste IFI pode eventualmente apresentar grave redução em sua sensibilidade, ocasionando uma detecção apenas parcial dos cães infectados com Leishmania
chagasi. Em vista deste fato e considerando que o IFI é amplamente utilizado pelos órgãos de saúde pública, é compreensível a limitada eficiência da eliminação de cães soropositivos como medida de controle da LV. A periódica validação do IFI, comparando-o com testes mais sensíveis, ou a adoção do teste de ELISA na rotina diagnóstica da leishmaniose canina é recomendação válida com vistas à otimização das ações de controle e monitoramento dessa zoonose em suas áreas de ocorrência endêmica.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio na for- ma de bolsas de iniciação científica para as graduandas Lídia Silva de Oliveira, Daniela Souza Freitas e Bárbara Maria Paraná da Silva Souza.
REFERÊNCIAS
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4 8 ALVES, L. M. et al. – Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico ...
