Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Em solução fisiológica, o ácido hialurônico é polianiônico de grupos carboxil nos resíduos de ácido glicurônico e assume uma forma.
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
1 / 66
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Dissertação de mestrado apresentada ao Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial paraa obtenção do título de Mestre em Bioquímica Orientador: Prof. Dr. João Felipe de S. Filho
EXTRAÍDA DO MOLUSCO MESOGASTROPODA AMPULARIDAE^ “PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA^ Β-GLUCURONIDASE Pomacea sp” ” ,
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande doNorte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em: 18/04/
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. João Felipe de Sousa Filho Departamento de Bioquímica - UFRN Orientador
Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior Departamento de Bioquímica - UFPE 1º Examinador
____________________________________________________ Profª. Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN 2º Examinador
Ao Prof. Dr. João Felipe de Sousa Filho, minha sincera admiração e meus agradecimentos pela confiança em mim depositada, pelos ensinamentos e acima de tudo, pela amizade.
Ao meu pai eterno, Deus por sempre iluminar meus passos e me dar força parasuperar dificuldades e alcançar meus objetivos.
A todos professores do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte Aos professores da banca de qualificação Prof. Luiz Diz Abreu e Prof. Roberto Dimenstein pelas correções e sugestões apresentadas Aos colegas do Departamento de Bioquímica que se tornaram grandes amigos: Tarciana, Shyrley, Robério, Carol, Leonardo Rêgo, Celina, Vanessa (do GAGS),Noberto, Vanessa (do laboratório).
Um agradecimento muito especial aos meus companheiros, irmãos que serão sempre lembrados em minha mente: Lorena, Juliana e Fabiano. A Ana Katarina, por muito pacientemente me ensinar e acompanhar em vários experimentos. A Eliene, Itamar, Creusa, Jonas, Marcos, Margarita e Kildary pela amizade a auxílio prestado quando precisei. Ao meu noivo André, grande companheiro que se preocupa em me fazer feliz e me proporciona momentos de intensa alegria. À minha prima que é como uma irmã Cris, pela cumplicidade e minha filhinha lindaLaila, a sementinha mais linda e doidinha que Deus plantou na Terra.
Aos meus irmãos Yara, Yon, Yoná e Benedito Jr. e sobrinhos, Alan e Ninho. A CAPES, pelos recursos financeiros cedidos para a realização deste trabalho.
Esse trabalho estuda a via enzimática envolvida no metabolismo de glicosaminoglicanos sulfatados no molusco Pomacea sp. Foram identificadas atividades exo e endoglicosidásicas no extrato protéico do molusco Pomacea sp por meio de hidrólise do p-Nitrofenil-β-glucuronídeo e atividade em condroitim sulfato de cartilagem de baleia, respectivamente. O tecido obtido do molusco foi homogeneizado a 4ºC com tampão acetato de sódio, em seguida centrifugado a 8.000 x g e a proteína presente no sobrenadante foi submetida ao fracionamento com crescentes concentrações de sulfato de amônio, sendo a atividade glicosidásica maior visualizada na fração F 2 (50-80%). A β-glucuronidase (F 3 ) foi isolada em cromatografia de gel filtração Bio-gel A 1.5m, o grau de purificação de 6.362,5 vezes foi ratificado em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com um rendimento de 35,6%. A β- glucuronidase isolada neste trabalho apresenta uma massa molecular de 100 kDa, determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida. A determinação dos parâmetros cinéticos ideais para a catálise do p-nitrofenil-ß-glucuronídeo pela β- glucuronidase, apresentou atividade ótima em pH 5,0 e temperatura de 65ºC por 4 horas e um Km aparente de 72 x 10 -2^ mM. São necessárias para a degradação total de 3mM de p-N-β-glucuronídeo, a quantidade de 1,2μg de β-glucuronidase. O BaCl 2 aumentou a atividade da β-glucuronidase e a atividade foi inibida completamente pelos compostos SDS e NaH 2 PO (^4)
This work studies the involved enzymatic way in the metabolism of glycosaminoglycans sulfateds in the mollusc Pomacea sp. Had been identified endoglycosidases and exoglycosidases in the enzymatic extract of the mollusc Pomacea sp by means of hydrolysis activity in condroitim sulphate of whale cartilage and of the p-Nitrofenil-β- glucuronide, respectively. The enzymatic extracts qere obtained of Pomacea sp. being used of 0.1 sodium acetate buffer, pH 5.0 and later centrifugated the 8,000 x g and the presents proteins in the sobrenadante were submitted to the fractionament with two crescents ammonium sulphate concentrations, the visualized activity biggest in the F (^2) fraction (50-80%). The β-glucuronidase (F 3 ) was isolated in gel chromatography filtration Biogel 1.5m, the purification degree was ratified in Chromatography Liquid of high efficiency (HPLC). The enzyme was purificated 6.362,5 times with 35,6% yield. The β -glucuronidase isolated in this work showed a molecular mass of 100 kDa, determined for eletroforese in poliacrilamida gel. The determination of the ideal kinetic parameters for the catalysis of the p-nitrofenil- β -glucuronide for β-glucuronidase, showed excellent activity in pH 5,0 and temperature 65ºC for 6 hours and apparent K (^) m of 72 x 10 -2^ mM. It is necessary for the total degradation of 3mM of p-N-β-glucoronide, the amount of 1,2μg of ss-glucuronidase. The BaCl 2 increased the activity of ss- glucuronidase, and the activity was inhibited completely by the composites SDS and NaH 2 PO (^4)
Etapas de purificação ..............................................................................................
AH = Ácido Hialurônico A. niger = Aspergillus niger A. pullulans = Aureobasisium pullulans A. tubingensis = Aureobasidium tubigensis CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência cm = Centímetro CoA = Coenzima A CS = Condroitim sulfato DS = Dermatan sulfato F 1 = Fração 1 F 2 = Fração 2 F 3 = Fração 3 GAG = Glicosaminoglicanos GAGS = Glicosaminoglicanos sulfatados Gal = Galactose GalNac = N-acetil-galactosamina GlcA = Ácido glucurônico GlcNS = N-acetil-glucosulfato GluNac = N-Acetil-glucosamina Xil = Xilose Hep = Heparina HS = Heparam sulfato IdoA = Ácido Idurônico IUBMB = International Union of Biochemistry and Molecular Biology kDa = Quilodalton Km = Constante de Michaelis-Menten KS = Queratam sulfato M = Molar
estes, pois a maioria dos estudos ainda não incluíam os proteoglicanos, concentravam-se exclusivamente nas cadeias de glicosaminoglicanos, moléculas responsáveis primárias pelas interações biológicas mediadas por proteoglicanos (NAKATO; KIMATA, 2002; CAPILA; LINHARDT, 2002) Glicosaminoglicanos são polissacarídeos lineares, negativamente carregados com repetições de unidades dissacarídicas constituindo de um resíduo de açúcar não nitrogenado (ácido idurônico, ácido glucurônico ou galactose) e um resíduo de hexosamina (glucosamina ou galactosamina) (ERNST et al ., 1995), que se encontram covalentemente ligados ao core protéico de proteoglicanos através de uma região tetrassacarídica formada por um ácido glicurônico-galactosil-galactosil-xilose (GlcUA- Gal-Gal-Xil), conforme visualizado na figura 3 (SUGARAHA; KITAGAWA, 2000)
FIGURA 3 – REGIÃO DE LIGAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS AO NÚCLEO PROTÉICO
A classificação dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) baseia-se, principalmente na estrutura química desses açúcares complexos e os relaciona em função do tipo de hexosamina encontrada, que pode ser N-acetilada, N-sulfatada, N- acetilada-6-sulfatada, N-acetilada-4-6-dissulfatada, do açúcar não nitrogenado (ácido idurônico e ácido glicurônico), do tipo de ligação glicosídica (intra e interdissacarídicas, α-1,4; β-1,3 ou β-1,4) e, também pela presença, quantidade e posição dos grupamentos sulfato (NADER, 1991; PAVÃO et al ., 1995; NADANAKA et al ., 1998; NADER et al ., 1999b). Dessa maneira, podem-se distinguir os diversos tipos de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) em : ácido hialurônico (AH), único não sulfatado e que não se liga ao core protéico; condroitim 4 e 6 sulfato (CS); heparam sulfato (HS), heparina (Hep), dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS) (DIETRICH; NADER; STRAUS, 1983; DIETRICH et al ., 1998; 1999), como mostrado na figura 4 (HANDEL et al ., 2005) O ácido hialurônico (hialuronato) tem uma estrutura de GAG simples que consiste de um polímero alternado de N-acetilglucosamina e ácido glicurônico, aproximadamente 50.000 unidades dissacarídicas repetitivas, unidas por uma ligação glicosídica β-(1,3) (LODISH et al ., 2000). Ao contrário dos outros GAGS, o ácido hialurônico não é sintetizado covalentemente ligado a um núcleo protéico e assim, é classificado simplesmente como GAG e não como PG, além de ser o único não sulfatado (KJÉLLEN; LINDAHL, 1991). Em solução fisiológica, o ácido hialurônico é polianiônico de grupos carboxil nos resíduos de ácido glicurônico e assume uma forma um tanto rígida, ou fortuitamente, pode formar estruturas retorcidas. A molécula pode emaranhar-se através de interações associativas específicas com um grande número
dispersar. Defeitos na sulfatação ou distorções na cadeia, causam a má organização da fibra e a conseqüente opacidade da córnea (Ceratocone) (VARKI et al. , 1999).
Figura 4 - UNIDADES DISSACARÍDICAS CONSTITUINTES DOS GLICOSAMINOGLICANOS. X = H ou SO 3 − (^) e Y = H, COCH 3 , ou SO 3 −; GlcA, Ácido glucurônico; GlcNAc, N-Acetil-glucosamina; GlcNS,galactosamina. N-acetil-glucosulfato; IdoA, Ácido Idurônico; Gal, galactose; e GalNAc, N-acetil-
Heparina (Hep)
Heparam Sulfato(HS)
Condroitim Sulfato(CS)
DermatamSulfato (DS)
Queratam Sulfato (KS)
Ácido Hialurônico (AH)
O heparam sulfato e heparina possuem praticamente as mesmas estruturas químicas com uma diferença no maior grau de sulfatação e maior ocorrência de ácido idurônico da heparina (HANDEL et al ., 2005). Além disso, um grande número de mudanças ocorre durante ou imediatamente após a alongação da cadeia. Primeiro, a proporção de grupos acetil é diminuída com adição de sulfato para formar glicosaminas N-sulfatadas, assim, adicionando cargas negativas. Menos de 50% dos grupos N-acetilados são normalmente convertidos a N-sulfatados no heparam sulfato e 70% ou mais são convertidos na heparina (KJÉLLEN; LINDAHL, 1991). Ocorre sulfatação na posição dois e epimerização do ácido glicurônico para ácido idurônico, como também, a sulfatação no carbono 6 da glucosamina. A sulfatação no carbono dois do ácido glucurônico ocorre como prevenção a um possível retrocesso na epimerização desse ácido. A estrutura final da heparina é polianiônica, freqüentemente carreia quatro potentes ânions por dissacarídeo: um carboxil, um N- sulfato e dois O-sulfato. Ocasionalmente em muitos tipos de células, a posição 3 da glicosamina é sulfatada, isso favorece a ligação da heparina ao sítio de ligação da antitrombina III, e assim exerce uma função essencial na atividade anticoagulante da heparina (ATHA et al ., 1984). Os efeitos de vários GAGS na atividade da anti-trombina III foram testados usando substratos sintéticos. (HOMMA et al ., 2005). Heparam sulfato e heparina são particularmente importantes dentre os glicosaminoglicanos por suas propriedades em ligar-se a um grande número de diferentes proteínas com funções complexas na matriz extracelular regulando uma ampla variedade de processos celulares, incluindo hemostasia, inflamação, angiogênese, fatores de crescimento, adesão celular, dentre outras (CONRAD, 1998)
