Prácticas de laboratorio del Biología Molécular
Integrantes: Mariana Gutiérrez, Juanita Vélez, Juan Pablo Aguiiar
https:// UNIVERSIDAD EIA - Prácticas de Laboratorio
https:// UNIVERSIDAD EIA - Prácticas de Laboratorio
SALTING-OUT
Es un método que se utiliza
comúnmente para separar el ADN de
otros componentes celulares , como
proteínas y lípidos . Se utiliza una
solución de sal, para ajustar la
concentración iónica del medio. Se
basa en la capacidad de de la sal
para inducir la agregación de
proteínas y la capacidad del
disolvente orgánico de precipitar
selectivamente el ADN.
PCR
Es una técnica para la amplificación
exponencial de una región específica
del ADN, permitiendo la detección y
análisis de secuencias genéticas en
muestras. Este proceso implica
replicar en el laboratorio el proceso
natural de replicación del ADN que
ocurre en las células.
ELECTROFORESIS
Sirve para separar moléculas en
función de su tamaño y su carga. Su
mecanismo de acción se basa en el
movimiento de las moléculas
cargadas eléctricamente a través de
la superficie hidratada de un medio
sólido. Se pasa una corriente por y
las moléculas con carga negativa, se
mueven hacia el ánodo (+), mientras
que las de carga negativa hacia el
cátodo (-).
Realizar la purificación de ADN de una muetsra de sangre mediante
el método Salting-out.
Ejecutar de manera analítica y experimental la técnica de PCR
convencional sobre el ADN purificado.
Evaluar los parámetros de calidad de las muestras de ADN
obtenidas.
Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular
Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
Para aprender más sobre la
Para aprender más sobre la
técnica PCR:
técnica PCR:
Para aprender más sobre la
Para aprender más sobre la
técnica Salting-out
técnica Salting-out
Para aprender más sobre la
Para aprender más sobre la
técnica de electroforesis
técnica de electroforesis
METODOLOGÍA
PCR
Esta es una descripción de las etapas que ocurren una vez se
ingresa la muestra al termociclador y se corre el programa de
PCR.
Desnaturalización
Hibridación
Elongación
Propósito: separar las dos
hebras de la molécula de
ADN.
Temperatura: entre 90 °C -
94 °C
El calor rompe los enlaces de
hidrógeno, provocando la
separación de las hebras.
Temperatura: entre 50 °C
- 65 °C para permitir la
unión de los cebadores.
Los cebadores se unen a sus
secuencias complementarias
en las hebras de ADN.
Alineación de primers.
Temperatura:
Aproximadamente 72 °C es la
temperatura óptima para la
actividad de las Taq
Polimerasa.
La ADN polimerasa añade
nucleótidos, extendiéndo y
sintetizando nuevas hebras de
ADN complemnetarias a las
plantillas. Al final, la hebra ha
sido replicada produciendo dos
moléculas de soble hebra.
PASOS PCR
PASOS PCR
Preparar una
Preparar una
mezcla de
mezcla de
reacción
reacción
Colocar la
Colocar la
mezcla en el
mezcla en el
termociclador
termociclador
(ver tabla)
(ver tabla)
Repetir los
Repetir los
ciclos (entre
ciclos (entre
30 y 35
30 y 35
veces)
veces)
Termociclador
Se debe preparar una
mezcla que incluye el
ADN putificado + un
mastermix.
¿Qué contiene el
Mastermix?
ADN Taq Polimerasa +
dNTP’S + Buffer +
Cofactores + Primers
específicos para la
betaglobina.
MEZCLA PARA PCR
MEZCLA PARA PCR
¿Qúe debe contener la mezcla?
Obtener la muestra de sangre periférica (aproximadamente
Obtener la muestra de sangre periférica (aproximadamente
10mL).
10mL).
Para iniciar con el protocolo es necesario realizar la
Para iniciar con el protocolo es necesario realizar la lisis de los
lisis de los
glóbulos rojos
glóbulos rojos utilizando
utilizando Cloruro de Amonio
Cloruro de Amonio.
.
Luego es necesario centrifugar y en esta parte del procedimiento,
Luego es necesario centrifugar y en esta parte del procedimiento,
se descarta el sobrenadante y se debe cuidar el
se descarta el sobrenadante y se debe cuidar el botón de
botón de
blancos
blancos (el precipitado o
(el precipitado o pellet
pellet). Si es necesario, se debe de
). Si es necesario, se debe de
lavar el botón de blancos con
lavar el botón de blancos con Cloruro de Amonio
Cloruro de Amonio hasta eliminar
hasta eliminar
los residuos de sangre.
los residuos de sangre.
Añadir la solución de
Añadir la solución de lisis de blancos
lisis de blancos y
y proteinasa K
proteinasa K para
para
degradar proteínas.
degradar proteínas.
Precipitar el ADN utilizando
Precipitar el ADN utilizando isopropanol frío
isopropanol frío y lavar con
y lavar con
etanol al 70%
etanol al 70%
Secar y resuspender el pellet de ADN en
Secar y resuspender el pellet de ADN en buffer TE.
buffer TE.
Evaluar parámetros de calidad con el Nano-droop.
Evaluar parámetros de calidad con el Nano-droop.
Lisis de
blancos Proteinasa
K
Buffer
TE
Alcoholes
Cloruro
de Amonio
METODOLOGÍA SALTING-OUT
METODOLOGÍA SALTING-OUT
RESULTADOS
RESULTADOS
Solución de sangre + Cloruro de
Amonio. Foto tomada después de la
lisis de globúlos rojos.
Resultado obtenido después de
realizar la lisis de blancos. Se observa
el sobrenadante y el pellet.
Fase final de la técnica de Salting - Out.
ADN resuspendido en buffer TE. Foto
tomada Antes de llevar al Nano-droop.
Foto de la mezcla para PCR (ADN
extraído + mastermix). Foto tomada
antes de llevar al termociclador.
Resultado de la electroforesis. Foto
editada por la docente LENKA TORO.
Resultado de la curva arrojada por el
Nano-droop. Foto tomada luego del
análisis de la muestra.
METODOLOGÍA ELECTROFORESIS
METODOLOGÍA ELECTROFORESIS
Preparar un gel de agarosa
Preparar un gel de agarosa
en una solución buffer.
en una solución buffer.
Cargar las muestras de ADN
Cargar las muestras de ADN
amplificado y un marcador
amplificado y un marcador
de peso molecular en los
de peso molecular en los
pocillos del gel.
pocillos del gel.
Correr la electroforesis
Correr la electroforesis
aplicando voltaje (80-120 V)
aplicando voltaje (80-120 V)
hasta que los colorantes de
hasta que los colorantes de
carga migren
carga migren
adecuadamente.
adecuadamente.
Visualizar las bandas de
Visualizar las bandas de
ADN bajo luz UV después
ADN bajo luz UV después
de teñir el gel con un
de teñir el gel con un
colorante que permita su
colorante que permita su
visualización.
visualización.
En esta práctica de laboratorio, se llevaron a cabo tres técnicas fundamentales en el campo de la biología
En esta práctica de laboratorio, se llevaron a cabo tres técnicas fundamentales en el campo de la biología
molecular:
molecular: Salting-out
Salting-out,
, PCR
PCR y
y Electroforesis
Electroforesis. El salting out, también conocido como precipitación por
. El salting out, también conocido como precipitación por
sales se utilizó para aislar ADN de una muestra sanguínea. Por otra parte, la PCR (Polymerase Chain Reaction)
sales se utilizó para aislar ADN de una muestra sanguínea. Por otra parte, la PCR (Polymerase Chain Reaction)
se empleó para amplificar un fragmento específico de ADN aislado, mientras que la electroforesis permitió
se empleó para amplificar un fragmento específico de ADN aislado, mientras que la electroforesis permitió
separar y visualizar el ADN presente en la muestra. Estas tres técnicas se realizaron de manera secuencial y
separar y visualizar el ADN presente en la muestra. Estas tres técnicas se realizaron de manera secuencial y
permitieron una mayor comprensión de las temáticas abordadas en las clases, y un acercamiento de los
permitieron una mayor comprensión de las temáticas abordadas en las clases, y un acercamiento de los
estudiantes a procesos muy importantes en el área de las ciencias de la vida.
estudiantes a procesos muy importantes en el área de las ciencias de la vida.
CONCLUSIONES: Se lograron realizar las cuatro técnicas moleculares con éxito, a pesar de algunos errores que se pudieron haber
cometido por la falta de experiencia y por ser la primera vez de los estudiantes enfrentándose a esta técnica.
Es posible que el ADN de la muestra haya sufrido procesos de degradación durante la extracción, ya fuera por exposición a
endonucleasas o agitación excesiva.
A la hora de realizar la técnica de Salting-out pudo haber ocurrido una contaminación cruzada.
A lo largo de todas las técnicas, pudieron haber ocurrido errores de pipeteo.
El voltaje de la fuente de poder de la electroforesis pudo no haber sido suficiente para correr adecuadamente la técnica molecular.
DISCUCIÓN: El ADN puesto en el pozo número 6, de acuerdo a lo s resultados envíados por la docente no se ve en la lectura,
probablemente o salió del gel de agarosa o no había presencia de ADN, por lo cual no se pueden registrar cambios respecto al
ladder. Además en la muestra de ADN genómico se evidencia que es el de mayor peso.