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Manejo Integrado de Plagas y Agroecología (Costa Rica) No. 77, 2006
Artículos
Cultivo de meristemas, termo y quimioterapia en
chayote (Sechium edule Jacq. Sw.) para la erradicación
del virus del mosaico del chayote (ChMV)
. bdelour-Esquivel 1 L.C. Bermudez^2 S. lvreg 3 C. River 4 RESUMEN. Recientemente se identificó en Costa Rica una nueva enfermedad viral en chayote, denominada "virus del mosaico del chayote" (ChMV, Chayote mosaic virus ). demás de dismiuir los redimietos, est efermedd cus reduccioes y mlformció de los frutos, lo que evetulmete podrí icidir e el icremeto de frutos rechzdos pr l exportció. L efermedd puede ser trsmitid durte l propgció vegettiv y por l semill. El cultivo de meristems se utiliz e muchs especies pr l errdicció de virus y resturr l sidd de los mteriles pr l producció. L termo y l quimioterpi so técics que sols o e combició co el cultivo de meristems tmbié se utilizan para este fin. El objetivo del presente estudio fue establecer una metodología que permitiera la regeneración de plts prtir del cultivo de meristems de chyote y evlurl como medio pr l limpiez del virus del mosico del chyote e plts ifectds. Pr ests pruebs se utilizro dos tmños de explte y se evluó el efecto de vrios reguldores de crecimieto diciodos l medio de cultivo Murshigue y Skoog sobre l formció de plátuls. E los cloes evludos, l dició de 0,10 mg L -1^ de B promovió el myor porcetje de regeerció de plátuls e los dos tipos de expltes utilizdos. L termo y quimioterpi plicds vitroplts y meristems, respectivmete, fectro egtivmete el desrrollo de los expltes y o permitiero su regeerció. Co l icubció de brotes de chyote e Ribviri® (virzol) se logró l errdicció del virus, pero ls plátuls regeerds mostrro poco crecimieto, mrillmieto y poco o igú desrrollo de ríces. Los resultdos obteidos e est experieci prece idicr que el cultivo del domo picl de ls plts ifectds es l práctic más recomedble pr logrr l regeerció de plts libres del ChMV.
Palabras clave: Cucurbitcee, errdicció de virus, Tymovirus , virzol.
AbSTRACT. Meristem culture, thermo- and chemotherapy to eradicate ChMV in chayote ( Sechium edule Jacq. Sw.). Recently in Costa Rica a new viral disease was identified in chayote, the Chayote mosaic virus (ChMV). Aside from decresig productivity, this disese cuses reductio i size d the mlformtio of fruits, which could evetully icrese the percetge of rejected fruits. It c be trsmitted durig vegettive d seed propgtio. Meristem culture is used i my species to erdicte virus d to restore the helth of productio mterils. Thermo d chemotherpy re lso techiques tht, loe or i combitio with meristem culture, re used for the sme purpose. I this study we imed to estblish methodology to llow the regeertio of chyote plts from i vitro cultures of meristems d to evlute it s me to erdicte ChMV from ifected plts. Two sizes of explts were evluted, logside the effect of severl plt growth regultors o plt regeertio. The dditio of 0,10 mg L -1^ of B produced the highest percetge of regeerted plts. Thermo d chemotherpy pplied to vitroplts d meristems, respectively, egtively ffected explt developmet d o regeertio ws obtied from the treted mteril. Icubtio of chyote shoots i virzol llowed virus erdictio but regeerted plts showed poor growth, yellowish colortio d little or o root developmet. We recommed the culture of the picl dome of ifected plts s the best techique to regeerte chyote plts free of ChMV.
Keywords: Cucurbitcee, Timovirus , virzol, virus erdictio.
(^1) Ce tro de I vestig ció e Biotec ologí (CIB), I stituto Tec ológico de Costa Rica. C rt go, Cost Ric. bdel our@itcr. c.cr (^2) Escuel de Biologí , I stituto Tec ológico de Cost Ric. C rt go, Costa Rica. (^3) Ce tro de I vestig ció e Biotec ologí (CIB), I stituto Tec ológico de Cost Ric. C rt go, Costa Rica. s lv re g@itcr. c.cr (^4) Ce tro de I vestig ció e Biologí Celul r y Molecul r (CIBCM) y F cult d de Microbiologí , U iversid d de Cost Ric. S José, Costa Rica. criver@r cs .co.cr
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Introducción
L micropropgció permite l multiplicció clol msiv y rápid de plts. Por lo geerl, el proceso se iici co el estblecimieto i vitro de brotes, udos, segmetos de hoj o ríz y, e lguos csos, de embrioes cigóticos (expltes) e codicioes séptics de cultivo (Villlobos y Thorpe 1991). Gracias a la desinfección superficial de los expltes durte el proceso de estblecimieto i vitro y l cultivo e codicioes séptics e evses cerrdos, se obtiee plts libres de cotmites exteros que pued cusr efermeddes, pero o se segur que ls plts se ecuetre libres de getes sistémicos como los virus, que tmbié cus pérdid de clidd y reducciones significativas en el rendimiento de los cultivos. Si embrgo, etre ls técics del cultivo de tejidos vegetles se ecuetr el cultivo de meristems, que se utiliz e muchs especies vegetles pr l errdicció de virus (shmore 1997). Est técic se fudmet e que l distribució de los virus o es uiforme y que su cocetrció tiede dismiuir progresivmete hci el meristem picl del tllo, dode ls céluls se ecuetr e costte y rápid divisió. Otros métodos como l termo y l quimioterpi, solos o e combició co el cultivo de meristems, tmbié se utiliz pr el semieto de plts ifectds co virus (Ncimieto et ál. 2003). Recientemente se reconoció e identificó en pltcioes comerciles de chyote ( Sechium edule ) e Cost Ric u efermedd virl deomid “mosico del chyote”, cusd por el Chayote mozaic virus (ChMV). Los sítoms más frecuetemete observdos e ls plts ifectds por este virus so mchs y illos cloróticos, que meudo se ue pr formr mosicos completos y hojs deformes. T mbié cus reducció e el tmño y malformación de frutos (Figura 1). El virus fue identificado como miembro del géero Tymovirus , cuyo geom cosiste de u RN de cde simple, de setido positivo. Su ámbito de hospederos se limit uos pocos miembros de l fmili Cucurbitcee (Hord et ál. 1997, Berl et ál. 2000). demás de ser trsmitido mecáicmete, se trsmite por l semill (Mcy-Lizo 2000) 1 , medio trdiciol de propgció de l especie. Esta investigación se realizó con el fin de establecer u metodologí p r l rege er ció de pl t s p rtir de meristem s pic les de ch yote como medio p r err dic r el ChMV e pl t s i fect d s, sí como ev lu r l efectivid d de la termo y la quimioterapia para el mismo fin.
Materiales y métodos
Recolección del material vegetal El mteril vegetl (brotes y frutos) de chyote del tipo quelite fue recolectdo de pltcioes comerciles ubicds e l zo de Ujrrás (proximdmete 1000 msm), ctó de Príso, provici de Crtgo, Cost Ric, que mostrb l sitomtologí del virus. Estos mteriles se llevro l Lbortorio de Cultivo de Tejidos del Cetro de Ivestigció e Biotecologí (CIB) del Istituto Tecológico de Cost Ric, dode se relizó l ivestigció e cultivo i vitro. Los mteriles de chyote utilizdos se deomiro JM1, JM2, JM3, 13, Ifectdo 1, Ifectdo 2, PS1 y PS2 pr fcilitr el recoocimieto de su procedeci.
Obtención del material vegetal in vitro Los brotes de ch yote del tipo quelite (JM1, JM2, I fect do 1, I fect do 2 y 13) fuero i troducidos l cultivo i vitro siguie do l metodologí descrit por bdel our et ál. (2002). Después de u desi fecció co hipoclorito de c lcio (4% i. .) dur te 6 mi utos, los expl tes fuero e ju g dos tres veces co gu destil d estéril y luego est blecidos séptic me te e el medio de cultivo descrito por Mur shige y Skoog (MS) (1962), co 30 g L-1^ de s c ros y 2,2 g L- de Phyt gel (medio de cultivo básico). El pH se justó 5, tes de l esteriliz ció del medio e utocl ve. P r el est blecimie to i ici l de los brotes el medio fue e riquecido co 0,05 mg L-1^ de be cil de i. P r l i troducció de embrio es cigóticos l cultivo i vitro, se recolect ro frutos de pl t s que prese t b l si tom tologí típic de i fecció por el ChMV y se tom ro t mbié hoj s y brotes de l s pl t s co sí tom s p r comprob r, por medio de l téc ic D S-ELIS , si ést s efectiv me te est b infectadas con el ChMV. Estas plantas fueron identificadas como PS1 y PS2. Los frutos fuero l v dos co gu y j bó y l s semill s se isl ro cort do el mesoc rpo co u cuchillo. P r l desi fecció , l s semill s se i cub ro e u solució de hipoclorito de c lcio (6,5% i. .) dur te qui ce mi utos. Después de tres e ju gues co gu destil d estéril y e co dicio es séptic s, l s semill s fuero cort d s p r isl r el eje embrio rio y p rte de los cotiledo es ( lv re g y Morer 1992). Los embrio es isl dos fuero coloc dos e u medio MS compleme t do co 400 mg L-1^ de c seí hidroliz d. Los cultivos se coloc ro e el cu rto de crecimie to u temper tur de e tre 20 y 22 °C, u i te sid d lumí ic de proxim d me te 2000 lux y u fotoperíodo de 16 hor s.
(^1) M c y Liz o, V. 2000. S José, CR, CIBCM-U iversid d de Cost Ric. (Comu ic ció perso l).
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diero positivo l preseci del virus. Por otr prte, cudo se islro y cultivro úicmete los domos picles de ls vitroplts (0, 0,2 mm, si primordios folires evidetes), se observó que el 86% de estos fuero cpces de regeerr plts cudo el medio básico fue eriquecido co 0,10 mg L -1^ de B. Porcetjes similres de regeerció de plts fuero observdos co l dició de Ze e cocetrcioes de 0,0022 mg L-1^ (79%), 0,022 mg L -1^ (87%) y 0,22 mg L-1^ (87%). u cudo o se ecotrro diferecis estadísticamente significativas (según prueba de Tukey, p > 0,05) etre los trtmietos, e cuto l porcetje de plantas regeneradas y el número de nudos/brote al final del período de 9 sems de cultivo, durte ls primers dos sems de cultivo, los expltes e ls myores cocetrcioes de Ze (0,022 y 0,22 mg L -1^ ) mostrro myor diferecició y crecimieto (2,8 y 2,5 udos/brote, respectivmete) que los cultivdos e preseci de 0, mg L -1^ de B y 0,0022 mg L-1^ de Ze (2,1 y 2,0 udos/ brote, respectivmete). Tods ls plátuls se mostrro vigoross y de colorció verde oscuro. El álisis serológico pr detectr l preseci del
ChMV e ls plátuls de chyote regeerds prtir del cultivo del domo picl mostró porcetjes reltivmete ltos de plts ss e los diferetes mteriles evludos: 60% e 13, 60% e JM-1 y 33% e Ifectdo-1.
Termoterapia Trs icubr ls vitroplts de chyote e codicioes de lts temperturs durte u mes se observó u fuerte reducció e el crecimieto y el blqueo de ls vitroplts, y los meristems picles isldos o fuero cpces de desrrollrse y muriero los pocos dís.
Quimioterapia Tods ls cocetrcioes de virzol evluds resultro tóxics pr los meristems de chyote (si distigo del tmño del explte) y o se logró l regeerció de plátuls. Si embrgo, cudo se cultivro brotes proveietes de plts de proximdmete 35 dís e cultivo, estos presetro crcterístics diferetes segú el tipo de trtmieto l cul fuero sometids. Pr el cso del trtmieto testigo (si virzol), ls vitroplts presetro u vigor ceptble, sistem rdiculr desrrolldo y l myorí de ls plts lczro u tmño igul o superior 10 cm (Figur 2). E geerl, ls vitroplts mostrro hojs clorótics y mosicos, e lgus se observó ecrosis y muerte de ls hojs. Por otr prte, e el trtmieto co 10 mg L -1^ de virzol se observó que lguos brotes o logrro formr u plt complet. proximdmete el 50% de los brotes e este trtmieto o logrro formr ríces, el tmño de los brotes lczó lrededor de 3 cm. Los sítoms de l efermedd fuero evidetes e lgus plts. Cudo el trtmieto cosistió de 20 mg L -1^ del viricid se observó que l myorí de ls plts lczro u logitud etre 4 y 10 cm. Cerc del 50% de ls vitroplts e este trtmieto o desrrollro ríces y tods mostrro hojs clorótics (Figur 3 ). Los brotes estblecidos e el trtmieto que cosistió de 40 mg L -1^ de virzol desrrollro plátuls co hojs pequeñs, lgus co etreudos muy cortos y l myorí de ells si sistem rdiculr. E pocs plts se otó l preseci de los sítoms de l efermedd. E lguos brotes l preseci de hojs mrillets fue evidete (Figur 3). Co bse e el álisis serológico pr detectr l preseci o useci del ChMV e vitroplts cultivds durte 35 dís, se determió que el 75% de ls veite muestrs del trtmieto testigo fuero positivs pr el virus. Pr el cso del trtmieto co 10 mg L -1^ de virzol, ls plts que diero positivo represetro u 25% del totl de ls veite muestrs y quells plts que creciero
Cuadro 1. Regeneación de plántulas de chayote a pati del cultivo in vit o del meistema apical (0,3 a 0,5 mm de longitud)
Tratamiento (mg L-1^ )
Plántulas desarrolladas (%) O BA 23 c 0,05 BA 60 b 0,10 BA 85 a 0,05 BA + 0,10 GA 3 62 b 0,10 BA + 0,10 GA 3 76 ab
Nota: BA = benciladenina; GA 3 = ácido gibeélico. Cada expeimento consistió de 20 explantes po tatamiento y cada tatamiento fue epetido t es veces. Núme os seguidos de la misma leta no difie en estadísticamente.
Figura 2. Vit oplantas de chayote (A) infectadas po el vius del mosaico de chayote (ChMV), y (B) vit oplanta sana egeneada a pati del cultivo del domo apical.
A B
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e el trtmieto co 20 mg L -1^ de virzol fuero positivs e u 65% del totl de veite. Por último, el trtmieto co 40 mg L -1^ del tivirl resultó e u 5% de plts positivs pr l preseci del virus. El álisis de vriz y l prueb de comprció de medis (Tukey) mostrro diferecis etre los trtmietos testigo y el esyo co 40 mg L -1^ de virzol ( p = 1). No se presetro diferecis estadísticas significativas entre los demás tratamientos.
Discusión
El cultivo de meristem s co siste e utiliz r como m teri l i ici l p r l microprop g ció el domo meristemático y el p r de primordios foli res (0,2 0,5 mm) que lo comp ñ. Existe m yor posibilid d de éxito e l err dic ció de virus si se cultiv sol me te el domo pic l, pero l prob bilid d de que este sobreviva sin los primordios es menor; por lo tanto, la composició del medio de cultivo es crític p r su des rrollo (Kyte 1987). E ge er l, se dice que p r l microprop g ció el cultivo de meristem s pic les co dos o más p res de primordios foli res o requiere de sust ci s de crecimie to exóge s, pero si o i cluye los primordios foli res, l dició de regul dores de crecimie to es i dispe s ble (Hurt do y Meri o 1987, M l uri et ál. 1998). Lo terior co cuerd co los result dos obte idos e este estudio. u cu do se observó l rege er ció de meristem s e el medio de cultivo básico si regul dores del crecimie to (23%), l dició de 0,1 mg L-1^ resultó en un incremento significativo en la regeneración de pl t s (85%). lv re g et ál. (1999) e co tr ro que l combi ció 0,1 mg L-1^ de B y 0,1 mg L-1^ de G 3 e medio de cultivo de meristem s fue u tr t mie to decu do. E el prese te estudio, es combi ció de regul dores de crecimie to t mbié i dujo u lto porce t je de rege er ció (76%), pero o se difere ció est dístic me te del primer tr t mie to me cio do (0,1 mg L-1). T mpoco se difere ció de los tr t mie tos co 0,05 mg L-1^ de B i del tr t mie to co 0,05 mg L-1^ de B + 0,10 mg L-1^ de G 3. Debido l prese ci del ChMV e l s pl t s rege er d s p rtir de meristem s de proxim d me te 0,3 0,5 mm, se procedió
isl r y cultiv r ú ic me te el domo pic l de l s vitropl t s (0,1 0,2 mm), y que e tre más pequeño el expl te utiliz do p r l microprop g ció , m yores so l s posibilid des de err dic r el virus. Cu do se ev luó el efecto de l ze ti p r celer r el proceso de rege er ció de l s pl t s y se comp ró co el efecto del B (0,10 mg L-1) o se observ ro diferencias significativas en los porcentajes de regeneración, i e el úmero de udos/pl t. Debido l difere ci e el costo de estos dos regul dores del crecimie to, el B serí el más recome d do p r utiliz r e l rege er ció del meristem completo (0,3 0,5 mm) y del domo (0,1 0, mm). Si emb rgo, el isl mie to y cultivo i vitro del domo pic l permitió l limpiez de ChMV. Difere ci s e el t m ño de los expl tes isl dos y cultiv dos explic los result dos obte idos. Es cl ro que l téc ic de cultivo de meristem s ofrece l oportu id d de err dic r p tóge os de m teri les veget les v liosos, pero o elimi l ecesid d de liz r los m teri les por l prese ci del virus ( shmore 1997). P r el s e mie to y l err dic ció de virus e cultivos grícol s t mbié existe otros métodos como l termo y l quimioter pi , que se utiliz solos o e combi ció co el cultivo de meristem s. L termoter pi se utiliz ruti ri me te e ceboll , jo, puerro y otr s liliáce s comerci les (Co ci y Nome 1991), fres (Co verse y T e 1984), yuc (CI T 1982), ñ me (M l urie et ál. 1998), per (Postm 1994) y e p p y c mote (Golmirz ie et ál. 1994). Si emb rgo, el éxito de estos tr t mie tos depe de de l c p cid d que te g el tejido p r soport r períodos l rgos de lt temper tur que inactiven el virus sin afectar significativamente su crecimiento y, de cuerdo co los result dos obte idos, este o p rece ser el c so del ch yote, y que l s vitropl t s i cub d s u temper tur de 30 ºC dur te u mes sufriero decolor ció y l ser disect do el meristem , este o fue c p z de rege er r u pl t y murió después de pocos dí s de cultivo e l s co dicio es orm les de rege er ció de estos expl tes. Por otr prte, l myorí de ls sustcis quimioterpéutics usds e plts h resultdo fitotóxicas, por lo que solamente se pueden emplear dosis o tóxics pr reducir l ts de multiplicció del virus y umetr l efectividd de otrs técics como el cultivo de meristems (CI T 1982). L cció tivirl del virzol es específica a un análogo del primer compuesto de purina, l iosi moofosfto (IMP) o ácido iosíico. El IMP constituye un punto de ramificación entre la biosíntesis de los ucleótidos de dei y l de los de gui (Mthews y V Hold 1998). Por lo tto, cudo l ezim IMP deshidrogenasa, que participa en esa ruta de ramificación, se ecuetr ihibid, l rut metbólic es bloqued si drse l formció de estos dos importtes ucleótidos (MP, GMP), de form que l replicció del ácido
Figura 3. B otes de chayote después de 35 días de cultivo en medio MS con (A) 20 mg L-1 de viazol y (B) 40 mg L-1 de viazol.
A B
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