Separación de Sustancias por Cromatografía en Columna: Un Estudio Práctico, Esquemas y mapas conceptuales de Organización y Gestión del laboratorio

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TP N° 6 Separación de

sustancias por cromatografía

en columna

Susana Núñez Laboratorio 2, comisión 01

Objetivos Separación de mezclas binarias de sólidos utilizando cromatografía en columna de sílica gel. Extrapolar condiciones cromatográficas de CCD a las condiciones de elución de la columna. Comprensión de los parámetros operativos asociados a la cromatografía. Introducción La cromatografía es una técnica que se basa en el principio general de distribución de un componente entre dos fases: una fija o fase estacionaria (FE) y otra fase móvil (FM). Se lo puede ver como una separación selectiva de los componentes de una mezcla por acción de la FM que fluye a través de la FE. Existen distintos tipos de cromatografía:

• De partición
• De intercambio iónico
• Filtración por geles
• De adsorción En este trabajo se utilizará la cromatografía por adsorción, fenómeno que ocurre sobre el gránulo de FE. Esto se fundamenta en la atracción entre el soluto (St) y el adsorbente para formar uniones de puente de hidrógeno y dipolo-dipolo. El St es adsorbido en la superficie del adsorbente y luego desorbido por el solvente (Sv) o FM. El Sv compite con la fuerza de adsorción de los solutos, forzando equilibrios adsorción - desorción. El componente más atraído por la FE será el más difícil de eluir, mientras que si es más atraído por la FM eluirá con mayor facilidad. Desarrollo experimental Se comprobó por CCD para ambas muestras qué solventes son los óptimos para la elución de cada componente presente en dichas muestras, partiendo de ciclohexano y acetato de etilo (AcOEt). Para la muestra coloreada se realizan las siguientes placas:

El siguiente paso de la experiencia constó en elegir los Sv’s adecuados para eluir la muestra incolora B2. Imagen 3: placas de sílica gel, de CCD para elección de Sv’s de elución ciclohexano:AcOEt para muestra B2. Revelado luz UV. Se decide el uso de ciclohexano, placa 4 de la imagen 3, para el armado de la columna, porque la muestra casi no se separa ni eluye. Como 1° Sv de elución se elige 95:5 porque se observa en la placa 5 que la muestra se separa, el componente “b” eluye y “a” se queda en la línea de siembra. No se elige 8:2 placa 1 debido a que “a” no queda tan pegado a la línea de siembra. 2° Sv placa 2, 1:1 porque el componente que estaba en la línea de siembra comienza a eluir y el ΔRf sigue siendo óptimo. Por último, como Sv 3 se decide usar 3:7 placa 3 de la imagen 3, debido a que el componente “a” eluye favorablemente para ser sacado de la columna. (cálculos de Rf en anexo) Ciclohexano:AcOEt Cantidad usada de Sv (ml) Tubos 95:5 10 1 y 2 1:1 15 3; 4 y 5 3:7 25 6; 7; 8; 9; 10 y 11 Tabla 1: mezclas de Sv, cantidad usada de Sv y en qué tubos se usó. Se fueron recolectando fracciones de aproximadamente 4 mL y sembrando en placa de sílica, tipo grilla como se ve a continuación en la imagen 4. Utilizando luz UV para confirmar visualmente la presencia de los componentes de la muestra. Imagen 4: Placa “Grilla de control”

Al ver la imagen 4, se puede observar en la grilla de control lo descripto a continuación:

• Tubo 1: Primera fracción de 4 ml (utilizando ciclohexano:AcOEt 95:5): sin presencia de compuestos de la muestra.
• Tubo 2: En la misma placa se siembra la fracción y se observa al revelar al UV la tenue presencia de un compuesto. Se cambia la polaridad del Sv por el 1: para que eluya más rápidamente el componente “b” y comience a eluir también “a” y que no haya difusión por quedar mucho tiempo en el mismo lugar.
• Tubo 3: Se sigue observando al revelar la presencia de una mancha pero más definida.
• Tubo 4: Se observa al UV que la mancha se vuelve tenue nuevamente.
• Tubo 5: No hay presencia visible de ningún compuesto de la muestra al revelar la placa. Nuevamente se cambia el Sv por uno más polar, esta vez por el 3:7 para hacer eluir “a” y retirarlo por completo de la columna.
• Tubo 6: Al revelar se ve una mancha suave.
• Tubo 7 y 8: Igual al anterior, presencia visible al UV de una mancha suave.
• Tubos 9; 10 y 11: Ya no se detectan visualmente manchas al UV. La polaridad de los solventes de elución se fue modificando para lograr, en primer lugar, una correcta separación de los compuestos presentes en ambas muestras debido a la diferencia de polaridad entre cada uno, comprobada anteriormente mediante CCD. Por otro lado, para evitar la difusión de los componentes se debe aumentar el poder eluotrópico de manera tal que la mayor parte de cada componente pueda ser correctamente extraído de la columna. Posteriormente se decide de cuáles tubos se realizará CCD para verificar la presencia o no de alguno de los componentes. Comparando con placa 2 de Sv 1: (cálculos de Rf en anexo) Imagen 5: Placas comparativas para confirmar presencia o no de muestra. Placa 2 y 6 de sílica gel, sv 1:1, revelado UV. Tubos 1; 4; 5; 6 y 9 en placa 6.

Difenilamina Acetanilida^ AcOEt (FM)^ Ciclohexano (FM) Sílica gel (FE) Poco polar. Par electrónico libre en resonancia con 2 anillos aromáticos. Puede formar pte H. Momento dipolar bajo. Tamaño considerable. Aunque el par e- libre resuena en el anillo y el carbonilo es polar: aceptor de pte H. El nitrògeno puede formar pte H. Atraído por la FE. Dipolo-dipolo Poco polar: Aceptor de pte H Dipolo-dipolo London muy bajas No polar, solamente fuerzas de London Polar, puede formar pte H con el soluto. Tabla 2: Polaridad de las moléculas La difenilamina es una amina poco polar, como puede observarse en la tabla 2, es una molécula que a pesar de poder formar pte H, es voluminosa con respecto a la otra molécula, la acetanilida. Tiene un par electrónico libre que resuena en los anillos aromáticos, por lo que está menos disponible y es menos polarizable. Por todo esto tiene menos interacción con la FE y eluye más fácilmente con la FM. Por otra parte, la acetanilida puede formar pte H, tiene un oxígeno que es aceptor de pte H, si bien el par electrónico del nitrógeno entra en resonancia con el anillo aromático y con el carbonilo lo que conforma una unión más fuerte con el adsorbente. Necesitando mayor polaridad en el Sv para que se desorba. Conclusión Tras hallar los solventes óptimos con éxito para el armado de la columna, para la siembra y la elución de la muestra, se logró separar cada compuesto presente tanto en la muestra coloreada como en la muestra B2. Profundizando en los conceptos de la cromatografía por adsorción para explicar los distintos resultados. Bibliografía Química Orgánica. Fundamentos Teórico-Prácticos para el Laboratorio. Galagovsky, Lydia. Eudeba. Ed. 2012. pp 125-164. UNGS-Instituto de Ciencias. Guía de Estudio-Laboratorio II. pp 42-47. Anexo Protocolo de separación de una mezcla de sustancias coloreadas.

1. Se realiza CCD para la elección de solventes de elución cromatográfica partiendo de mezclas de ciclohexano:AcOEt. Se elige 9:1 para eluir rojo Sudán y 1:1 para eluir Quinoline yellow.

2. Se procede al armado de la columna: se coloca un algodón dentro de la columna con la ayuda de una varilla de vidrio hasta la parte baja. Se moja con Sv de armado y se saca el aire.
3. Luego a un vaso de precipitados se agregan 4 g de sílica gel y 10 ml de Sv de armado (ciclohexano). Sonicar de ser necesario.
4. Se transfiere la suspensión de sílica gel a la columna con ayuda de un embudo.
5. Se hace pasar el Sv de armado por la columna equivalente al volumen de la misma, evitando la formación de burbujas (ayudarse con una perita de goma, dando pequeños golpes a la columna).
6. Se procede a cargar la muestra, 0,5 ml con pipeta pasteur se transfieren a la cabeza de la columna, abriendo el robinete para facilitar el ingreso de la muestra a la fase estacionaria aproximadamente 0,5 cm. Se vuelve a cerrar. Luego hacer un pequeño lavado de las paredes de la bureta para arrastrar posible muestra que hubiera quedado adherida a la misma, siguiendo el mismo procedimiento de apertura y cerrado de robinete para asegurar el ingreso de la muestra.
7. Se comienza la elución con Sv 9:1 (menos polar) cargando delicadamente con pipeta pasteur unos cm’s luego terminar de cargar con vaso de precipitados (7, ml aproximadamente)
8. Se recolecta el Sv que sale de la columna. Una vez que empieza a salir el colorante rojo se recoge en tubo de hemólisis. Al finalizar la recolección se procede al agregado del Sv 1:1 (más polar).
9. Se coloca un Erlenmeyer para el Sv que va saliendo, cuando llega la muestra se recoge en tubo de hemólisis.
10. Al finalizar se realiza CCD. Protocolo para la separación de una muestra binaria incolora (muestra B2) a. Se realizan CCD’s para la elección de solventes de elución cromatográfica partiendo de distintas mezclas de ciclohexano : acetato de etilo. b. Se procede al armado de la columna, colocando un algodón con la ayuda de una varilla de vidrio hasta la parte baja, cuidando de no apretarlo mucho para no formar un tapón. Mojar con solvente de armado (ciclohexano) y sacar el aire. c. En un vaso de precipitados se agregan 4,0 g de sílica gel y 10 ml de ciclohexano aproximadamente. Se transfiere esta suspensión a la columna con ayuda de un embudo. d. Se hace pasar el solvente de armado por la columna, equivalente al volumen de la misma, evitando la formación de burbujas, para esto utilizar una perita de goma dando pequeños golpes a la columna. e. Se procede a cargar 5 gotas de muestra, transfiriéndola a la cabeza de la columna con una pipeta pasteur, abriendo el robinete para facilitar el ingreso de la muestra a la fase estacionaria aproximadamente 0,5 cm. Se vuelve a cerrar. Luego hacer un pequeño lavado de las paredes de la bureta para arrastrar posible muestra que hubiera quedado adherida a la misma, siguiendo el mismo procedimiento de apertura y cerrado de robinete para asegurar el ingreso de la muestra.

Rf de placas de CCD de imagen 5: Comparación de placas 2 y 6 para confirmar presencia o no de muestra. Tubos 1; 4; 5; 6 y 9 en placa 6. Solamente se observan al UV manchas en tubos 4 y 6. Placa 2 Placa 6 Rfa= 1,1cm/4cm=0,28 Rf6= 1,2cm/4cm=0, Rfb= 3,5cm/4cm=0,88 Rf4= 3,4cm/4cm=0, ΔRf= 0,6 ΔRf= 0, Tabla 5: Comparación de placas 2 y 6 (imagen 5) Rf de placas 7 y 8, imagen 6 para confirmación de identidad de la muestra. Placa 7 Placa 8 Rfbenzamida= 0,6cm/3,8cm=0,16 Rfbenzamida= 0,6cm/3,8cm=0, Rfácido salicílico= 0,1cm/3,8cm=0,03 Rfácido salicílico= 0,1cm/3,8cm=0, Rfmuestra 3= 3,4cm/3,8cm=0,9 Rfmuestra 7= 1,2cm/3,8cm=0, Rfacetanilida= 1,4cm/3,8cm=0,37 Rfacetanilida= 1,2cm/3,8cm=0, Rfdifenilamida= 3,4cm/3,8cm=0,9 Rfdifenilamida= 3,4cm/3,8cm=0, Tabla 6: Placas 7 y 8 de comparación de patrones con muestras para confirmar identidad de muestras Masa de muestras obtenidas Difenilamina mBalón vacío= 55,6872g mBalón con difenilamina= 55,5049g mDifenilamina= -0,1823g Resultado negativo, no tiene sentido. Se presume error al copiar de la balanza Acetanilida mBalón vacío= 114,8952g

mBalón con Acetanilida= 114,8996g mAcetanilida= 0,0044g