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EL LIPOPOLISACARIDO BACTERIANO: UNA POTENTE ENDOTOXINA
CON MULTIPLES ACTIVIDADES BIOLOGICAS
RECIENTES AVANCES EN ESTRUCTURA,
GENÉTICA Y BIOQUIMICA
Norman Rojas Campos*
RESUMEN
Los lipopolisacáridos (LPS) constituyen el antígeno O y la endotoxina de las bacterias Gram-negativas. Están localizados en la membrana externa de la envoltura celular bacteriana y juegan un papel muy importante en la patogénesis de las infecciones bacterianas, así como en la interacción con el hospedero y su sistema de defensa. Básicamente el LPS se compone de una porción lipídica muy conservada entre las especies, denominada lípido A, inmersa en la cara externa de la membrana externa de la bacteria, y una porción hidrofílica compuesta por azúcares que presenta una gran variabilidad estructural. El lípido A es responsable de las propiedades patofisiológicas de las endotoxinas. El polisacárido O, que es la porción mas externa, le confiere a la bacteria su especificidad serológica. El oligosacárido nuclear o core une el polisacárido O al lípido A. En general, los genes responsables de la síntesis del LPS están organizados ya sea en grupos de genes contiguos como en la síntesis del núcleo y el polisacárido 0, o bien, dispersos alrededor del
- Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica. Fax: 225-2374. Tel.: 207- Correo electrónico normanr@cariari.ucr.ac.cr
cromosoma bacteriano como en el caso del lípido A. La mayoría de los pasos de la vía biosintética del LPS han sido elucidados al menos en las enterobacterias. Tanto las interacciones moleculares de enzimas y sustratos durante la síntesis como el transporte del LPS hasta la membrana externa bacteriana son aspectos de constante investigación hoy en día, debido a las implicaciones en la biología de estos microorganismos y en el potencial uso farmacológico de análogos o antagonistas de LPS en la terapéutica del choque endotóxico. Esta revisión pretende actualizar los aspectos relevantes de la estructura, bioquímica y genét ica de esta importante molécula bacteriana. (Rev. Cost. Cienc. Méd. 1995; 16 -3: 71- 84)
INTRODUCCION
Los lipopolisacáridos (endotoxinas, LPS) de las bacterias Gram-negativas son los principales constituyentes de la membrana externa de estos microorganismos. Estas moléculas han sido aisladas de una gran variedad de bacterias Gram-negativas y algunas cianobacterias, y sus características estructurales y biológicas están siendo extensamente estudiadas. Sin embargo, la mayoría del conocimiento actual acerca de la biosíntesis y relaciones estructura- función de los lipopolisacáridos ha sido obtenido principalmente de estudios con
Salmonella typhimurium y Escherichia coli. La gran relevancia de estas moléculas en las infecciones bacterianas, particularmente en el choque séptico, actualmente constituye un objetivo importante desde el punto de vista farmacológico y terapéutico. El estudio de la estructura de este polisacárido complejo tuvo mucho auge desde la década de los años 50, llevando a la elucidación de la estructura del LPS de S. typhimurim en los años
- Una gran cantidad de cepas mutantes han contribuido a estas investigaciones como piezas de un complicado rompecabezas, las cuales han suministrado estructuras intermediarias en la biosíntesis cuyas propiedades bioquímicas e inmunoquímicas han podido ser utilizadas para deducir estas vías metabólicas. Asimismo, los estudios genéticos que han acompañado a la caracterización bioquímica de los mutantes han generado una enorme cantidad de información acerca de los genes involucrados (1). En esta revisión se pretende actualizar los aspectos básicos de la arquitectura y bioquímica de los lipopolisacáridos con el propósito de comprender su relación con los efectos biológicos de estas moléculas en animales y seres humanos.
ARQUITECTURA GENERAL DE LOS LIPOPOLISACARIDOS
A pesar de que existe una inmensa diversidad estructural en los lipopolisacáridos de bacterias Gramnegativas, hay elementos arquitectónicos que son compartidos por las distintas especies bacterianas. El lipopolisacárido típico de S. Typhimurium consiste en un
heteropolisacárido fosforilado que está covalentemente unido a un lípido de la membrana externa que contiene glucosamina, el lípido A. La porción de polisacárido que protruye de la membrana externa ha sido dividida en dos regiones principales: una región interna o central (núcleo o core) y una porción externa denominada cadena 0 (antígeno 0 ó polisacárido 0). La región del núcleo ha sido a su vez subdividida en una región interna y una región externa. La cadena 0 constituye la porción inmunodominante de la molécula, y los determinantes estructurales de esta región proveen la base de la clasificación serológica de la familia Enterobacteriaceae (2). La Fig. 1 muestra la representación esquemática de una molécula de LPS de S. typhimurium. El LPS es a menudo llamado endotoxina. Este término fue introducido en el siglo XIX para describir el componente bacteriano responsable de los fenómenos patofisiológicos asociados con las infecciones por Gramnegativos (3, 4). El lípido A posee la actividad endotóxica del LPS, como ha sido demostrado usando lípido A obtenido sintéticamente (5). Dentro de las actividades biológicas mas relevantes están la potente activación de macrófagos y la producción de gran cantidad de citoquinas y otros mediadores con múltiples efectos en diferentes órganos (3). Las cepas tipo silvestre de las especies de Salmonella, E. coli y otras bacterias Gram- negativas capaces de sintetizar moléculas de lipopolisacárido completas se denominan cepas lisas, por su morfología colonial. Estos organismos reaccionan con anticuerpos específicos contra sus cadenas 0, y usualmente
en el ensamblaje de la membrana externa. Lipopolisacáridos no tóxicos o de baja toxicidad están ampliamente distribuidos entre las bacterias distantes filogenéticamente de las entero-bacterias, como lo son bacterias fototróficas (Rhodopseudomonas sp.), bacterias nodulantes (Bradyrhizobium sp.), bacterias del suelo (ThiobaciIIus sp.), y algunos patógenos importantes (Brucella sp.). Todas estas especies muestran diferencias estructurales en su lípido A, comparados con el lípido A de enterobacterias, las cuales están localizadas en el esqueleto de azúcar o en el espectro de ácidos grasos (11). Dentro de las principales diferencias estructurales se encuentran la ausencia del grupo fosfato unido al esqueleto de diglucosamina y sustitución por 4 aminoarabinosa (12); la presencia de 2,3- diaminoglucosa (GIcN3N) como en Rhodopseudomonas viridis, o bien, el llamado lípido A “mixto”, que contiene glucosamina y 2,3- diaminoglucosa (10); y, finalmente, presencia de una amplia gama de ácidos grasos de diferente longitud (13). Núcleo o Core. El oligosacárido nuclear puede ser subdividido en un subdominio interno y uno externo. Los componentes del núcleo interno en Salmonella y E. coli incluyen ciertos azúcares únicos que son característicos del LPS, tales como el ácido 3-desoxi-D-manooctuIosónico (Kdo) y L-glicero-D-manoheptosa (Hep) (6). El núcleo externo esta compuesto por hexosas, principalmente glucosa, galactosa y N-acetil- glucosamina. La diversidad estructural de la región externa esta prácticamente limitada a los lipopolisacáridos de enterobacterias,
en las cuales se encuentran de uno (Salmonella) a cinco (E. coli) tipos diferentes de núcleo (14). En espec ies no entéricas, el núcleo externo puede estar también presente, pero a menudo esta completamente ausente (15). La región nuclear interna presenta una variabilidad mucho menor, al menos en enterobacterias. La mayoría de estas bacterias contienen dos residuos de Kdo y dos unidades de heptosa, y la presencia de sustituyentes tales como pirofosforiletanolamina le confiere heterogeneidad al núcleo interno. En H. influenzae, el Kdo mas interno puede estar fosforilado, mientras que en Acinetobacter calcoaceticus, un isómero del ácido octulosónico parecido al Kdo está unido al lípido A (7). Al menos un residuo de Kdo, o un derivado, está presente en todos los lipopolisacáridos conocidos, lo cual indica un papel esencial de este azúcar en la supervivencia y crecimiento de bacterias, particularmente a nivel del ensamblaje de la membrana externa (7).
Cadena 0. Los estudios realizados en lipopolisacáridos de enterobacterias han suministrado una serie de características que sirven para diferenciar la cadena 0 de otras partes de la molécula. En este grupo bacteriano las cadenas específicas unidas al núcleo consisten en una secuencia repetida de unidades de trisacárido o pentasacárido lineal, o bien pueden ser polímeros de oligosacáridos ramificados de cuatro a seis azúcares. La longitud de las cadenas 0 difiere aun en un mismo organismo, en un ámbito que varía desde 0 hasta 40 unidades repetitivas (16). Los monosacáridos que componen las unidades repetitivas son azúcares
neutros y acídicos, amino azúcares, y raras veces azúcares inusuales, tales como 6- desoxihexosas ó 3,6-didesoxihexosas. De acuerdo con cálculos en modelos moleculares, la orientación espacial del polisacárido 0 no asume una conformación ordenada y lineal, sino mas bien enrrollada (16), o doblada en un ángulo variable (17). En bacterias no entéricas, como por ejemplo bacterias fotosintéticas, bacterias del suelo, o en patógenos tales como Neisseria, Pasteurella, Campylobacter, Bordetella y Bacteroides, el polisacárido 0 esta totalmente ausente (14). En Brucella la cadena 0 es un homopolímero de un solo amino azúcar llamado perosamina (18). A pesar de que la gran diversidad inmunológica presente en el polisacárido 0 sugiere grandes diferencias estructurales, pequeños cambios pueden ser detectados serológicamente. Así pues, aun cuando la estructura química de la unidad repetitiva de Salmonella typhimurium (grupo B) es muy similar a la de S. typhi (grupo D), son inmunológicamente diferentes (6). En otros géneros y familias bacterianos, la presencia de azúcares metilados, acetilados o con otros grupos sustituyentes y amino azúcares juegan el papel de estructuras “inmunodominantes” (12). Ejemplos de componentes estructurales del polisacárido 0 en varias especies bacterianas se muestran en el Cuadro 1. La diversidad estructural de la cadena 0 puede ser aumentada por el proceso de conversión por bacteriófagos. Este proceso involucra la lisogenización de una cepa hospedera por un bacteriófago temperado capaz de dirigir alteraciones
estructurales específicas en las unidades repetitivas (6). Algunos autores sugieren que la diversidad en estructura y composición de la cadena 0 pudo haberse desarrollado durante la evolución, al menos en especies endosimbióticas, con el fin de escapar al sistema inmune del hospedero mediante la presentación de nuevas especificidades en la superficie celular y así esconder las unidades mas profundas, esto es, lípido A-núcleo int erno, los cuales son esenciales para el crecimiento y multiplicación bacterianos. De esta manera, la cadena 0 protegería a las bacterias contra la fagocitosis y contra la acción bactericida del suero (14).
2. BIOSÍNTESIS
Lípido A. El primer paso de la biosíntesis del lipopolisacárido en E. coli es la acilación de una molécula de N-acetilglucosamina activada con difosfato de uridina (UDP -GIcNAc) con una molécula de ácido ß-hidroximirístico ( carbonos). Tanto el UDP -GIcNAc como el complejo ß-hidroximiristoil-proteína acarreadora de acilo se encuentran en bifurcaciones metabólicas clave para la bacteria, como lo son, además de la biosíntesis del lípido A y el núcleo interno, la síntesis de peptidoglicán y de glicerofosfolípidos, respectivamente (7, 19). La posterior acilación del monosacárido da como resultado una molécula precursora llamada lípido X, mono-sacárido fosforilado y acilado en las posiciones 2 y 3 con ácido ß-hidroximirístico. La reacción del lípido X con un derivado activado del lípido X (UDP-2,3 diacil-GIcN) produce un precursor disacárido con cuatro grupos acilo, el lípido IVA (20). El lípido IV (^) A es
Finalmente, el último paso consiste en la transferencia del polímero recién sintetizado desde el lípido acarreador hacia el núcleo completo. Todos estos pasos son realizados por una serie de enzimas asociadas a la cara citoplasmática de la membrana. Una característica importante de la polimerización de la cadena 0 es que cada tetrasacárido recién sintetizado es incorporado en el extremo reductor de la cadena creciente (29). Esto posee la ventaja de que la enzima polimerasa no requiere localizar el extremo no reductor del polímero creciente, el cual esta probablemente lejos de la membrana y del sitio activo de la polimerasa. Sin embargo, este ciclo biosintético no parece ser común a todos los lipopolisacáridos estudiados (6,7). En algunos casos hay evidencias de síntesis de cadena 0 utilizando el extremo no reductor del polímero, pero la enzimología no ha sido esclarecida aun.
3. GENETICA
Lípido A. Los genes que participan en la biosíntesis del A no están agrupados de manera tan evidente como los que participan en la síntesis del polisacárido 0. Varios genes de las reacciones tempranas de la vía se hallan localizados en un operon complejo y heterogéneo cerca del minuto 4 del mapa de ligamiento físico de E. coli K12, el cual también contiene genes relacionados con el crecimiento y la síntesis de macromoléculas (30), mientras que otros genes están diseminados alrededor del cromosoma. La transferencia del grupo acilo (ácido ß-hidroximirístico) al UDP-GlcNAc en el primer paso de la síntesis de lípido A
es llevada a cabo por una aciltransferasa muy especifica codificada por el gen IpxA localizado en el minuto 4 del mapa de E. coIi Kl2 (31). El gen IpxA es parte de un grupo de 11 genes organizado en un operon complejo llamado operon de síntesis macromolecular II, en cual incluye otros genes vitales para la bacteria (30). Esto reafirma aun mas la naturaleza esencial de la vía del LPS en bacterias Gramnegativas. La posterior acilación de esta molécula para formar el lípido X es realizada por los productos de los genes IpxC y IpxD (20). La reacción de condensación que lleva a la formación del lípido IVA es catalizada por el producto del gen IpxB (32). El lípido IVA es la primera estructura que exhibe algunas de las características que definen la endotoxina bacteriana, aun cuando no es tóxica como el LPS mismo (21, 33). La posibilidad de usar el lípido IV como un precursor y manipular la síntesis del LPS abre una serie de alternativas interesantes para el desarrollo de agentes antimicrobianos y drogas diseñadas para combatir el choque endotóxico.
Núcleo o core. La mayoría de los genes que participan en la biosíntesis del núcleo se encuentran agrupados en el grupo rfa , que comprende 17 genes en E. coli Kl2 (34). El arreglo de los genes del LPS en grupos y en operones no siempre está en paralelo con la vía biosintética misma. Por ejemplo, la unión de los dos primeros residuos de Kdo al precursor de lípido IVA tiene lugar antes de la acilación final del lípido A. Asímismo, aun cuando muchos de los genes del núcleo están organizados en el grupo rfa , parte de esos genes están también involucrados en la unión de la cadena 0 al core.
Además, existen genes que participan en la biosíntesis del núcleo que no están localizados en este grupo principal. Dichos genes están involucrados en la síntesis del Kdo y son el gen kdsA, localizado en el minuto 27 (34), que codifica por a Kdo-8-fosfato sintetasa la cual genera el Kdo-fosfato. El gen kdsB, localizado en el minuto 85, cerca del grupo ,la, codifica por la enzima que activa el Kdo a CMP-Kdo. El gen k dtA, localizado en un extremo del grupo rfa , codifica a su vez por una enzima bifuncional que transfiere en forma secuencial las dos moléculas de CMP-Kdo al lípido IVA y además posee características que la hacen capaz de servir como anclaje de la molécula naciente de LPS a la membrana (35). Por su parte, los genes del grupo rfa codifican por una serie de glicosiltransferasas que actúan en forma secuencial, así como por otras enzimas accesorias que añaden grupos funcionales a diversas regiones del núcleo (36). Cadena 0. Como es generalmente cierto para las vías biosintéticas de carbohidratos complejos que han sido estudiadas a nivel genético, los genes tanto del núcleo como del antígeno 0 están organizados principalmente en agrupaciones de genes contiguos. En E. coli K12 y S. typhimurium estos grupos están presentes en dos regiones del cromosoma, cerca de los genes involucrados en la biosíntesis del polisacárido capsular. El grupo de genes rfa se localiza en la región entre el minuto 81 y el minuto 85, que flanquea el sitio de origen de la replicación del cromosoma. Por su parte, el grupo de genes rfb esta situado entre el minuto 44 y el minuto 4 del mapa físico del cromosoma de estas bacterias (30).
El grupo rfa, ademas de codificar por la biosíntesis del oligosacárido nuclear, lo hace también de la unión del antígeno 0 al núcleo, mientras que el grupo rfb contiene 16 genes en S. typhimurium, los cuales están involucrados en la síntesis del antígeno 0 yen su unión al núcleo. El número de genes en este último grupo varía con la composición de azucares en el antígeno 0. En ambos grupos Ja mayoría de genes codifican por proteínas solubles quede alguna forma están asociadas con la superficie interna de la membrana citoplasmática, y no se han encontrado aun proteínas que puedan ser translocados al periplasma o a la membrana externa. Muchas de estas proteínas operan como complejos multienzimáticos que sintetizan precursores activados de azúcares y como transferasas de residuos glicosídicos a las cadenas crecientes de azúcares, mientras que un número reducido de proteínas se encargan de la polimerización de las unidades y de la transferencia del antígeno 0 al complejo lípido A-núcleo (30).
CONCLUSIONES
El trabajo de un gran número de laboratorios por mas de 25 años ha permitido elucidar la mayoría de los pasos bioquímicos y su control genético involucrados en la biosíntesis del lipopolisacárido en Salmonella sp y E. coli. Sin embargo una serie de pasos y mecanismos aun quedan por resolverse completamente. Dado que tanto las unidades repetitivas de la cadena 0, así como el lípido A-núcleo son sintetizados en la cara interna de la membrana citoplasmática, debe existir un sistema de transporte de
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a Abe, abecuosa; Man, manosa: Ram, ramnosa; Gal, galactosa; Tiv, tivelosa;
Galc, glucosa; GalOAc, 0-acetilgalactosa; dAlt, desoxialtrosa;
AItNAc, ácido N-acetilaltrosaminuránico; FucNAc, N-acetilfucosamina;
GIcNAc, N-acetilglucosamina; Col, ácido colánico; ManNAc, ácido
N-acetilmanurónico.
