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Acta bioquím. clín. latinoam. vol.46 no.4 La Plata dic. 2012 HEMATOLOGÍA
Resistencia osmótica eritrocitaria en el diagnóstico de anemias
hereditarias en Tucumán, Argentina*
Red cell osmotic resistance in the hereditary anemias diagnosis in Tucumán, Argentina Resistência osmótica eritrocitária no diagnóstico de anemias hereditárias em Tucumán, Argentina Sandra Stella Lazarte^1 , Mónica Leri de Nofal^2 , Cecilia Jiménez^3 , Ana Cecilia Haro^4 , Mariana Burgos^5 , Blanca Issé^6 1 Doctora en Bioquímica. Bioquímica Especialista en Hematología. 2 Bioquímica. Especialista en Hematología. UNT. 3 Bioquímica. Especialista en Bioquímica Clínica- Modalidad Residencia. UNT. 4 Doctora en Bioquímica. 5 Estudiante de la Carrera de Bioquímica. UNT. 6 Doctora en Bioquímica. Bioquímica Especialista en Hematología.
- Instituto de Bioquímica Aplicada. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán. Balcarce 747. San Miguel de Tucumán. CP 4000. Resumen Las anemias hereditarias más frecuentes en Tucumán (Argentina) son el rasgo beta talasémico (RBT), las hemoglobinopatías estructurales (HBP) y la esferocitosis hereditaria (EH). La resistencia osmótica eritrocitaria inmediata y 24 horas post-incubación constituye el método diagnóstico de la EH, y como tubo único (ROETU) es usada para cribado de RBT. El propósito del trabajo fue determinar el comportamiento de ROETU (4,0 y 5,5 g/L de NaCl) en el diagnóstico de anemias hereditarias. Se estudiaron 125 pacientes: 34 normales (GN), 59 con RBT (GRBT), 21 con HBP (GHBP) y 11 con EH (GEH), que fueron agrupados en niños (≤12 años), mujeres y hombres (> años). Se realizaron hemograma (Coulter AcT10 y Sysmex KX-21N), índices de Mentzer y de Shine&Lal, ROETU, hierro, transferrina y saturación de transferrina (Wiener Lab), reticulocitos (azul brillante de cresilo), prueba de falciformación y electroforesis de hemoglobina a pH alcalino y ácido. GRBT presentó anemia microcítica hipocrómica, y GEH y GHBP, anemia normocítica normocrómica. El hierro fue normal. GRBT y GHBP fueron resistentes en ROETU 4,0 g/L, aunque GRBT mostró mayor resistencia ( p <0,05). GEH fue menos resistente que GN en ROETU 5,5 g/L ( p <0,05). ROETU 4,0 y 5,5 g/L serían recomendables en el diagnóstico presuntivo de RBT y EH, respectivamente.
Palabras clave: Resistencia osmótica eritrocitaria; Anemias hereditarias; Beta talasemia; Esferocitosis hereditaria; Hemoglobinopatías estructurales Summary Beta thalassaemia trait (BTT), structural hemoglobinopathies (SHB) and hereditary spherocytosis (HS) are the most frequent hereditary anaemias in Tucumán (Argentina). Immediately and 24 hours post-incubation red cell osmotic resistance is the diagnosis method of HS, and as a single tube (RORST), it is used for clínicamenBTT screening. The purpose of this study was to determine the RORST (NaCl 4.0 and 5.5 g/L) behaviour in the diagnosis of hereditary anemia. The study encompassed 125 patients : 34 normal patients (NG), 59 with BTT (BTTG), 21 with SHB (SHBG) and 11 with HS (HSG), who were divided into children (≤12 years), women and men (> 12 years). Blood count (Coulter AcT10 and Sysmex KX-21N), Mentzer and Shine&Lal indexes, RORST, iron, transferrin and transferrin saturation (Wiener Lab), reticulocytes (brilliant cresyl blue), sickling and hemoglobin electrophoresis at alkaline and acid pH were performed. BTTG showed hypochromic microcytic anemia, and SHBG and HSG, normochromic normocytic anemia. Iron was normal. BTTG and SHBG were resistant in RORST 4.0 g/L, but BTTG showed more resistance ( p <0.05). SHG was less resistant than NG at RORST 5.5 g/L ( p <0.05). RORST at values of 4.0 and 5.5 g/L would be recommended for the presumptive diagnosis of BTT and SH, respectively. Key words: Red cell osmotic resistance; Hereditary anemia; Beta thalassaemia; Hereditary spherocytosis; Structural hemoglobinopathies Resumo As anemias hereditárias mais comuns em Tucumán (Argentina) são o traço beta talassemia minor (BTM), as hemoglobinopatias estruturais (HBP) e esferocitose hereditária (EH). A resistência osmótica dos eritrócitos imediata e 24 horas pós-incubação é o método de diagnóstico da EH, e como um único tubo (ROETU) é usado para a detecção de BTM. O objectivo deste estudo foi determinar o comportamento de ROETU (4,0 e 5,5 g/L de NaCl) para o diagnóstico de anemias hereditárias. Foram estudados 125 pacientes: 34 normais (GN), 59 com BTM (GBTM), 21 com HBP (GHBP) e 11 com EH (GEH), que foram reunidos em crianças (≤12 anos), mulheres e homens (>12 anos). Foi realizado hemograma (Coulter AcT10 e Sysmex KX-21N), índices de Mentzer e Shine&Lal, ROETU, ferro, transferrina e saturação de transferrina (Wiener Lab), reticulócitos (azul de cresil brilhante), teste de falcização e eletroforese de hemoglobina em pH alcalino e ácido. GBTM mostrou anemia microcítica hipocrômica, e GEH e GHBP, anemia normocítica normocrômica. O ferro foi normal. GRBT e GHBP foram resistentes em ROETU 4, g/L, mas GBTM mostrou maior resistência ( p <0,05). GEH foi menos resistente que GN em ROETU 5,5 g/L ( p <0,05). ROETU 4,0 e 5,5 g/L seria recomendado para o diagnóstico presuntivo da BTM e EH, respectivamente. Palavras-chave: Resistência osmótica dos eritrócitos; Anemias hereditárias; Beta talassemia; Esferocitose hereditária; Hemoglobinopatias estruturais Introducción La prueba de resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) proporciona una indicación de la razón volumen/superficie de los eritrocitos y refleja su capacidad para incorporar una cierta cantidad de agua antes de lisarse. La habilidad de los
membrana y generación de sustancias oxidantes. La Hb C es una molécula con una carga altamente positiva, solubilidad disminuida y tendencia a cristalizar. En un extendido de sangre periférica de hemoglobinopatía C se observan células en diana y células contraídas irregularmente (9). En trabajos previos se ha demostrado que la ß-talasemia menor, las hemoglobinopatías S y C y la EH son las anemias hereditarias más frecuentes en Tucumán (10). Aunque los estados heterocigotos de las variantes de Hb son típicamente asintomáticos, el diagnóstico es importante para el consejo genético, debido a la gravedad de los estados homocigotos. En el presente estudio se evaluó el uso de la prueba de ROE tubo único (ROETU) como método de cribado para la detección de dichas anemias hereditarias. Materiales y Métodos Diseño Se realizó un estudio observacional descriptivo, de corte transversal. Población, muestra y criterios diagnósticos Se estudiaron 91 pacientes que asistieron al Instituto de Bioquímica Aplicada para diagnóstico etiológico de anemia, y 34 sujetos normales, en el período comprendido entre noviembre de 2007 y junio de 2011. Se obtuvo un consentimiento informado para el uso de los resultados obtenidos, donde se garantizó el anonimato y confidencialidad. En el caso de los niños el consentimiento fue firmado por el padre o la madre. De cada individuo se obtuvo una muestra de sangre. La muestra fue recolectada en EDTA tripotásico para la realización del hemograma, en heparina para la realización de la prueba de resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) y otra alícuota sin anticoagulante para las determinaciones bioquímicas en suero. La EH se diagnosticó mediante la observación de esferocitos en el frotis sanguíneo y el aumento de fragilidad de los glóbulos rojos en la prueba de resistencia osmótica eritrocitaria inmediata y post-incubación durante 24 horas a 37 ºC. El diagnóstico de ß-talasemia menor incluyó la presencia de microcitosis e hipocromía, y un aumento ≥ 4% de la fracción de hemoglobina A 2 (HbA 2 ) en la corrida electroforética de hemoglobina. El diagnóstico de hemoglobinopatías se realizó a través del reconocimiento de bandas de hemoglobina con movilidad anormal en la electroforesis a pH alcalino, prueba de falciformación ante la sospecha de Hb S, y electroforesis a pH ácido para identificar las hemoglobinas anormales. Una vez diagnosticados, los individuos se dividieron en 4 grupos: grupo con rasgo ß-talasémico (GRBT), grupo con hemoglobinopatía (GHBP), grupo con esferocitosis hereditaria (GEH) y grupo normal (GN), los que a su vez fueron clasificados según la edad en mujeres y hombres (> 12 años) y niños (≤ 12 años). Estudios Hematológicos
Hemograma e índices hematimétricos: Se realizó en contador hematológico marca Coulter AcT10 (Miami, Estados Unidos) en el período 2007-2008 y en Sysmex KX- 21N (Kobe, Japón) durante el período 2009-2011. Para determinar la presencia de anemia se recurrió a los niveles de Hb. Se consideró anemia en mujeres cuando la Hb fue menor de 120 g/L; en hombres si la Hb era menor de 130 g/L; y en niños niveles inferiores a 110 g/L. Los índices hematimétricos volumen corpuscular medio (VCM) y hemoglobina corpuscular media (HCM) se utilizaron en la tipificación morfológica de la anemia. Con ellos la anemia se clasificó en microcítica (VCM<80 fL), normocítica (VCM 80-95 fL) o macrocítica (VCM>95 fL), de acuerdo al volumen; y en normocrómica (HCM=27-32 pg) o hipocrómica (HCM<27 pg), de acuerdo al contenido de Hb. Índices eritrocitarios de discriminación: Con los resultados de VCM, HCM y recuento de glóbulos rojos (RGR) se calcularon los índices de Mentzer (IM=VCM/RGR) y de Shine&Lal(S&L=VCM^2 xHCMx0,01) (6). El valor discriminante fue un resultado igual o menor de 13 para el IM, y menor o igual a 1530 para el de S&L (8) Recuento de reticulocitos e índice de producción reticulocitaria (IPR): Se efectuó mediante método manual con azul brillante de cresilo. El resultado se corrigió de acuerdo al hematocrito del paciente, y el IPR se calculó como: reticulocitos corregidos/2. Un IPR>2 indicó anemia regenerativa, mientras que un IPR≤2, anemia arregenerativa. Ferremia (Fe) y Capacidad Total de Unión de Hierro a Transferrina (CTUT): Se usó un equipo de Wiener Lab. Los valores de referencia (VR) de Fe son de 50- μg/dL en la mujer, y de 65-175 μg/dL en el hombre. El VR de CTUT es de 250- μg/dL. Saturación de transferrina: Es el resultado del cociente entre ferremia y CTUT, multiplicado por 100. El VR es de 20-50%. Electroforesis de Hemoglobina: La corrida se realizó en tiras de acetato de celulosa, en una cuba de electroforesis con fuente de poder (CHEMAR, Buenos Aires, Argentina). Se usó el buffer tris-EDTA-bórico pH 8,5. ROE tubo único inmediato (ROETUi): Se realizó con una solución salina hipotónica de 4,0 g/L de NaCl en buffer fosfato. A 5 mL de esta solución se agregaron 50 μL de sangre heparinizada del paciente. Además, se agregaron 50 μL de dicha sangre a 2 tubos más: uno con 5 mL de solución salina de 9,0 g/L de NaCl en buffer fosfato (0% hemólisis), y otro con 5 mL de agua destilada (100% de hemólisis). Luego de mezclar, los tubos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron, y los sobrenadantes se leyeron a 540 nm en espectrofotómetro (Metrolab 1600 plus, Buenos Aires, Argentina), usando como blanco el tubo 0% de hemólisis (9,0 g/L de NaCl). El porcentaje de hemólisis se calculó con la siguiente fórmula:
Tabla I. Parámetros hematológicos evaluados en los grupos de mujeres mayores de 12 años Tabla II. Parámetros hematológicos evaluados en los grupos de hombres mayores de 12 años
Tabla III. Parámetros hematológicos evaluados en los grupos infantiles El grupo GEH comprendió 8 niños de 1 a 11 años y 3 pacientes de 13, 15 y 31 años. Dicho grupo presentó anemia normocítica normocrómica, tanto en niños como en adultos, y aumento del IPR ( p <0,05) con respecto al GN, reafirmando la característica regenerativa de la misma. La ROETUi 4,0 g/L mostró glóbulos rojos más frágiles que los normales, aunque sólo se pudo comparar el grupo infantil con el normal, encontrándose diferencia significativa entre ambos ( p <0,05). La ROETU24 4,0 g/L no mostró diferencias con el grupo GN. El examen de la hemólisis 50% inmediata y pos-incubación demostró que el grupo GEH presentaba una resistencia disminuida con respecto al GN (Fig. 1) (Tabla IV). La prueba ROETU-5,5 inmediata y pos-incubación indicó un porcentaje de hemólisis mayor que el GN ( p <0,05). De acuerdo a los valores de corte propuestos, esta última prueba permitió detectar la presencia de EH en el 82% (8 individuos) y 100% de los pacientes en su modalidad inmediata y post-incubación, respectivamente. El análisis morfológico de los eritrocitos en extendidos sanguíneos reveló la presencia de esferocitos en el 100% del GEH.
Tabla IV. Resultados de la prueba de ROE completa y ROETU 5,5 g/L de NaCl en los grupos GEH y GN En el grupo GRBT se observó anemia microcítica hipocrómica en el 100% de los casos y no dependió de la edad ni del sexo. Dicho grupo estuvo integrado por 14 individuos de 1 a 12 años y 42 con edades comprendidas entre 17 y 82 años. Tanto la ROETUi y la ROETU24 4,0 g/L demostraron que los glóbulos rojos talasémicos fueron resistentes a concentraciones bajas de NaCl. El 90 y 91% de los individuos con RBT presentaron un porcentaje de hemólisis menor al 50 y 85% en la ROETUi y ROETU24 4,0 g/L de NaCl, respectivamente. Asimismo, los índices IM y S&L presentaron diferencias significativas con respecto a GN, y permitieron diagnosticar el 80 y el 98% de los casos de RBT, respectivamente. El grupo GHBP estuvo compuesto por 11 pacientes con hemoglobinopatía S heterocigota (rasgo falciforme), 2 con hemoglobinopatía S homocigota, 7 con hemoglobinopatía C heterocigota y 1 con hemoglobinopatía S-C. Dicho grupo consistió en 8 niños de 1 a 9 años y 13 mayores de 12 años, con edades entre 14 y 74 años. Al momento del diagnóstico sólo el 33% (7 casos) presentaba anemia. Ninguno de los hombres adultos tuvo niveles de Hb por debajo del valor de referencia. Con respecto a la ROETU 4,0 g/L inmediata y posincubación, se encontraron glóbulos rojos resistentes a la hemólisis (Tablas I y III), en especial en el grupo femenino mayor de 12 años. Si bien los grupos GRBT y GHBP fueron resistentes a bajas concentraciones de NaCl, el estudio comparativo entre ambos arrojó diferencias significativas ( p <0,05) y demostró que los pacientes con rasgo beta talasémico son más resistentes en las pruebas ROETUi y ROETU24 (Fig. 2).
Figura 2. Prueba de ROETU y ROETU24 en los grupos estudiados Discusión y Conclusiones El diagnóstico de las anemias hereditarias se basa en la combinación de la historia clínica y familiar, el examen físico y datos de laboratorio (hemograma, índices hematimétricos, morfología, recuento de reticulocitos y otros). La medición de la resistencia osmótica eritrocitaria da una información valiosa sobre la normalidad
consideran que el VCM y HCM pueden estar dentro del rango normal, pero con un ADE usualmente aumentado (2). Si bien se observó que la media de la CHCM en el GEH era mayor que en el GN, no hubo diferencias significativas entre ellos. Tampoco se encontró un VCM menor en el GEH, pero la observación de esferocitos en el frotis de sangre periférica fue un hecho constante en todos los pacientes con EH. La variación del VCM en la EH depende del grado de reticulocitosis, del nivel de hierro en sangre y del compromiso megaloblástico, entre otras causas (22). En el grupo GEH todos los sujetos presentaron un IPR>3, lo que probablemente determinó el hallazgo de un VCM normal. El diagnóstico de talasemias, esferocitosis hereditaria y hemoglobinopatías no es fácil en los laboratorios de bajos recursos, los cuales son frecuentes en países con problemas socioeconómicos como la Argentina. La implementación de la prueba de ROETU sería ventajosa, ya que es sumamente económica, y suficientemente sensible y específica para ser usada en el cribado de anemias hereditarias en regiones con recursos técnicos y financieros limitados. De manera ideal, un contador hematológico cuidadosamente estandarizado, debería orientar el diagnóstico de estas patologías. Pero cuando el medio no lo permite, la ROETU podría ser útil en la evaluación de muestras sospechosas, lo que reduciría el número de pacientes que deben ser derivados a centros de mayor complejidad. Correspondencia DRA. Sandra Lazarte. Laprida 653, 7º D. 4000 San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina Tel.: 0381-4310994. E-mail: slazarte@fbqf.unt.edu.ar Referencias bibliográficas
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