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Replicación del ADN 179 Reparación del ADN 192 Recombinación entre secuencias homólogas de ADN 204 Reorganización del ADN 211 EXPERIMENTO CLAVE: Reorganización de los genes de inmunoglobulina 214 MEDICINA MOLECULAR: Cáncer de colon y reparación del ADN 203 misión fiel de la información genética de padres a hijos. Por tanto, resulta esencial la replicación exacta del ADN genómico para la vida de todas las células y organismos. Cada vez que una célula se divide, su genoma completo debe duplicarse, necesitándose una compleja maquinaria para copiar las gran- des moléculas de ADN que componen los cromosomas procariotas y eucario- tas. Además, las células han desarrollado mecanismos para corregir los fallos que algunas veces se cometen durante la replicación del ADN y para reparar los daños que puedan surgir por la acción de agentes ambientales, como la radia- ción. Las anormalidades de estos procesos dan como resultado una replicación y un mantenimiento fallido del ADN genómico —un fallo que puede causar con- secuencias desastrosas, como el desarrollo de un cáncer—. A pesar de la importancia de la replicación exacta y el mantenimiento del ADN, los genomas celulares no son estáticos. Para que las especies evolucio- nen, son necesarias mutaciones y reorganizaciones para mantener la variación genética entre los individuos. La recombinación entre cromosomas homólogos durante la meiosis desempeña un importante papel en este proceso puesto que permite a los genes parentales reorganizarse en nuevas combinaciones en la siguiente generación. Las reorganizaciones de las secuencias de ADN dentro del genoma se cree que también contribuyen a la evolución mediante la crea- ción de nuevas combinaciones de información genética. Además, algunas reor- ganizaciones del ADN están programados para regular la expresión génica du- rante la diferenciación y el desarrollo de células individuales y organismos. En humanos, un ejemplo destacado es la reorganización de los genes de anticuer- pos durante el desarrollo del sistema inmunológico. Un cuidadoso equilibrio en- tre el mantenimiento y la variación de la información genética resulta por tanto crítico tanto para el desarrollo de los organismos individuales como para la evo- lución de las especies. E L PROCESO BIOLÓGICO FUNDAMENTAL DE LA REPRODUCCIÓN requiere la trans- Replicación del ADN Tal y como explicamos en el Capítulo 3, la replicación del ADN es un proceso semiconservativo en el que cada hebra parental sirve como molde para la sínte- sis de una nueva hebra hija complementaria. La enzima principal implicada es la ADN polimerasa, que cataliza la unión de los desoxirribonucleósidos 5'-trifosta- to (INTPs) para formar la cadena de ADN en crecimiento. Sin embargo, la repli- cación del ADN es mucho más compleja que una reacción enzimática. Están involucradas otras proteínas, y son necesarios mecanismos de lectura para 179 24, O AED OA 180 e Sección Il + Flujo de la información genética Figura 5.1 Aislamiento de un mutante deficiente en la polimerasa !. Un cultivo de E. colí fue tratado con un mutágeno químico, y se aislaron colonias individuales de bac- terias mediante su crecimiento en un me- dio semisólido. Se cultivaron y revisaron varios cientos de colonias para identificar a un mutante carente de polimerasa |. Cultivo de E. coli Tratamiento con el mutágeno Crecimiento en medio Colonias cim surgidas semisólido en placa de una sola de petri bacteria mutantes Cultivo de colonias individuales Búsqueda de la actividad polimerasa | para identificar al mutante carente de polimerasa | asegurar que la exactitud de la replicación es compatible con la baja frecuencia de errores que se permiten en la reproducción celular. También son necesarias proteínas adicionales y secuencias de ADN para iniciar la replicación y para copiar los extremos de los cromosomas eucariotas. ADN polimerasas La ADN polimerasa se identificó por primera vez en lisados de E. coli por Ar- thur Kornberg en 1956. La capacidad de esta enzima para copiar exactamente una hebra molde de ADN proporciona una base bioquímica para el modelo de replicación del ADN que inicialmente propusieron Watson y Crick, por lo que su aislamiento representó un descubrimiento importante en la biología molecular. Irónicamente, sin embargo, esta primera ADN polimerasa identificada (ahora llamado ADN polimerasa l) no es la enzima principal responsable de la replica- ción en E. coli. En su lugar, ahora está claro que tanto las células procariotas como eucariotas contienen diferentes ADN polimerasas con funciones distintas en la replicación y reparación del ADN. La multiplicidad de las ADN polimerasas se halló por primera vez mediante el aislamiento de una cepa mutante de E. colique era deficiente en la polimera- sa | (Fig. 5.1). Los cultivos de E. coli se trataron con un agente químico (un mutágeno) que induce una frecuencia alta de mutaciones, se aislaron colonias bacterianas individuales y se analizaron para una cepa mutante carente de la polimerasa 1. El análisis de unos pocos miles de colonias condujo al aislamiento del mutante deseado, que era casi completamente defectuoso en la actividad de la polimerasa |. De forma sorprendente, la bacteria mutante creció con nor- malidad, llegando a la conclusión de que la polimerasa | no es necesaria para la replicación del ADN. Por el contrario, la bacteria mutante era extremadamente sensible a los agentes que dañan al ADN (p. ej., la luz ultravioleta), sugiriendo que la polimerasa | está implicada principalmente en la reparación del ADN dañado en lugar de en la replicación del ADN per se. La conclusión de que la polimerasa | no es necesaria para la replicación impli- caba que E. coli debería contener otras ADN polimerasas, por lo que subsecuen- tes experimentos condujeron a la identificación de otras dos enzimas, llamadas ahora ADN polimerasa !! y ll. Los papeles potenciales de estas enzimas se in- vestigaron mediante el aislamiento de mutantes apropiados. En las cepas de E. coli con mutaciones en la polimerasa Il se observó que crecían y se comportaban con normalidad, por lo que el papel de esta enzima en la célula es desconocido. Los mutantes polimerasa Ill sensibles a la temperatura, sin embargo, fueron incapaces de replicar su ADN a altas temperaturas, y estudios subsecuentes han confirmado que la polimerasa |Il es la enzima replicativa principal en E. coli. Se sabe que, además de la polimerasa l!!, la polimerasa | también es nece- saria para la replicación del ADN de E. coli. El mutante original de la polimerasa Eno era completamente defectivo para esta enzima, y experimentos posteriores mostraron que la actividad de la polimerasa | residual en estas cepas desempe- ña un papel clave en el proceso de la replicación. La replicación del ADN de E. coli implica por tanto dos ADN polimerasas diferentes, cuyas funciones princi- pales se discuten a continuación. Las células eucariotas contienen cinco ADN polimerasas: z, fi, y, d, y e. La polimerasa ; se localiza en la mitocondria y es responsable de la replicación del ADN mitocondrial. Las otras cuatro enzimas se encuentran localizadas en el núcleo y son por tanto candidatas para la replicación del ADN nuclear. Las poli- merasas x, 0, y « están más activas en las células en división, sugiriendo que funcionan en la replicación. Por otro lado, la polimerasa /; está activa en las células en división y en no-división, sugiriendo que puede funcionar principal- mente en la reparación del ADN dañado. Dos tipos de experimentos han proporcionado posterior evidencia de los pa- peles de las polimerasas x, o, y « en la replicación del ADN. Primero, la replica- 24, O AED OA 182 e Sección Il + Flujo de la información genética Figura 5.3 Replicación del ADN de E. coli. (A) Una autorradiografía mostrando las bacterias que crecieron en "H]timidina durante dos generaciones para marcar el ADN, que se extrajo después para visualizarlo median- te una cinta fotográfica. (B) Este esquema ilustra las dos horquillas de replicación vistas en (A). (De J. Caims, 1963. Cold Spring Harbord Symp. Quant. Biol. 28:43.) más tarde en este capítulo, estas propiedades de las ADN polimerasas parecen ser críticas para el mantenimiento de la alta fidelidad de la replicación del ADN necesaria para la reproducción celular. Horquilla de replicación Las moléculas de ADN en proceso de replicación se analizaron por primera vez por John Cairns en experimentos en los que E. coli se cultivó en presencia de timidina radiactiva, lo que permitió la visualización por autorradiografía del nue- vo ADN replicado (Fig. 5.3). En algunos casos, se pueden observar moléculas circulares completas en proceso de replicación. Estas moléculas de ADN con- tienen dos horquillas de replicación, que representan las regiones de la sínte- sis activa de ADN. En cada horquilla las hebras parentales se separan y son sintetizadas dos nuevas hebras hijas. La síntesis de dos nuevas hebras de ADN complementarias a las dos he- bras de la molécula parental trajo consigo un problema importante para enten- der la bioquímica de la replicación del ADN. Puesto que las dos hebras de la doble hélice de ADN se disponen en direcciones opuestas (antiparalelas), la síntesis continua de dos nuevas hebras en la horquilla de replicación requeriría que una de las hebras se sintetizara en sentido 5' a 3' mientras que la otra se sintetizaría en el sentido opuesto (3' a 5). Pero la ADN polimerasa cataliza la polimerización de los dNTPs solamente en sentido 5' a 3”. Entonces, ¿cómo puede ser sintetizada la otra hebra de ADN? El enigma se resolvió mediante experimentos que mostraban que solo una hebra de ADN se sintetiza de manera continua en la dirección de la replicación del ADN; la otra se forma a partir de pequeñas piezas discontinuas de ADN que se sintetizan al revés con respecto al movimiento de la horquilla de replicación (Fig. 5.4). Estas pequeñas piezas del nuevo ADN sintetizado (llamados frag- mentos de Okazaki después de su descubrimiento) se unen por la acción de la ADN ligasa, formando una nueva hebra intacta de ADN. La hebra sintetizada de forma continua se denomina hebra conductora, debido a que su elongación en el sentido del movimiento de la horquilla de replicación expone el molde que se utilizará para la síntesis de los fragmentos de Okazaki (hebra tardía). Aunque el descubrimiento de la síntesis discontinua de la hebra rezagada proporciona un mecanismo para la elongación de ambas hebras de ADN en la horquilla de replicación, surgió otra pregunta: puesto que las ADN polimera- sas necesitan un cebador y no son capaces de iniciar la síntesis de novo, 0 TIE RE .. 0 (B) E ASA _-Hebra hija Horquilla de replicación Horquilla de replicación Hebra parental Capítulo 5 + Replicación, mantenimiento y reorganización del ADN genómico e 183 53 s3 53 Unión del fragmento de Okazaki a la hebra tardía Sintesis de los fragmentos de Okazaki Síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki Horquilla de replicación —, don Dirección de la replicación global Fragmento % 5 de Okazaki p Hebra Hebra conductora tardía ¿cómo se inicia la síntesis de los fragmentos de Okazaki? La respuesta son los fragmentos cortos de ARN que sirven como iniciadores para la replicación del ADN (Fig. 5.5). Al contrario que la síntesis de ADN, la síntesis de ARN es capaz de iniciarse de novo, y una enzima llamada primasa sintetiza los frag- mentos cortos de ARN (p. ej., de tres a diez nucleótidos de longitud) comple- mentarios a la hebra rezagada molde en la horquilla de replicación. Los frag- mentos de Okazaki se sintetizan mediante la extensión de estos iniciadores de ARN por la ADN polimerasa. Una consecuencia importante de estos iniciadores de ARN es que los nuevos fragmentos de Okazaki sintetizados contienen una unión ARN-ADN, cuyo descubrimiento proporcionó la evidencia del papel de los iniciadores de ARN en la replicación del ADN. Para formar una hebra tardía continua de ADN, los iniciadores de ARN deben eliminarse de los fragmentos de Okazaki y ser reemplazados por ADN. En £. coli, los iniciadores de ARN se eliminan por la acción combinada de la ARNasa H, una Síntesis del cebador de ARN ADN Iniciación de molde la síntesis de ARN 3 3 Primasa ADN polimerasa Figura 5.4 Síntesis de las hebras conductora y tardía de ADN. La hebra conductora se sintetiza de forma continua en la dirección del movimiento de la horquilla de replica- ción. La hebra tardía se sintetiza en pe- queños fragmentos (fragmentos de Oka- zaki) en sentido opuesto al resto de la replicación. Los fragmentos de Okazaki se unen después mediante la acción de la ADN ligasa. Figura 5.5 Origen de los fragmentos de Okazaki con cebadores de ARN. Fragmentos cortos de ARN sirven como iniciadores sobre los que puede actuar la ADN poli- merasa. Extensión del cebador de ARN por la ADN polimerasa A Capítulo 5 + Replicación, mantenimiento y reorganización del ADN genómico e 185 E. coli Síntesis de la hebra conductora pol 11 Mamíferos Síntesis de la hebra tardía >) Primasa a pol ar/primasa 3 pol dle cación del ADN y la purificación de proteínas de mamíferos necesarias para la replicación in vitro del ADN de SV40. Una clase de proteínas necesarias para la replicación se unen con las ADN polimerasas, aumentando la actividad de las polimerasas y manteniéndolas unidas al molde de ADN para que continúen la síntesis de la nueva hebra de ADN. Tanto la polimerasa Ill de E. coli como la polimerasa ó y « de eucariotas están asociadas a dos tipos de proteínas ac- Polimerasa 24, O AED OA Figura 5.7 Papel de las ADN polimerasas en E. coli. y en células de mamíferos. La he- bra conductora es sintetizada por las poli- merasa lll (pol 111) en E. coliy por la polime- rasas ó y « (pol 0/:) en las células de los mamíferos. En E. coli, una primasa inicia la síntesis de la hebra tardía, siendo leí- dos los iniciadores de ARN por la polime- rasa III. En las células de los mamiferos, la síntesis de la hebra tardía la lleva a cabo un complejo de primasa y polimera- sa z (pol x). Los fragmentos cortos de ARN-ADN sintetizados por el complejo son leídos por las polimerasas 0 y «. Figura 5.8 Proteínas accesorias a la polimerasa. (A) La proteína de enganche de carga (RFC en las células de mamíferos) se acopla al ADN en la unión entre el ceba- dor y el molde. La proteína de enganche deslizante (PCNA en las células de mamí- feros) se une adyacente a la RFC, unién- dose la ADN polimerasa a la PCNA. (B) Modelo de unión de la PCNA al ADN. (B, de T. S. Krishna, X. P. Kong, S. Gary, P. M. Burgers y J. Kuriyan, 1994. Cell 79: 1233.) 186 e Sección Il + Flujo de la información genética Movimiento de la horquilla de replicación Helicasa Proteínas simple Hebra — —Hebra conductora tardía Figura 5.9 Acción de la helicasa y las proteínas de unión al ADN de hebra simple. Las heli- casas desenrollan las dos hebras del ADN parentales situado en la cabeza de la hor- quilla de replicación. Las hebras de ADN desenrolladas son estabilizadas por las proteínas de unión al ADN de hebra sim- ple de manera que puedan servir como moldes para la síntesis de un nuevo ADN. Figura 5.10 Acción de las topoisomerasas durante la replicación del ADN. (A) Una vez que las dos hebras de ADN están desenrolla- das, el ADN que se encuentra en la cabe- za de la horquilla de replicación es forzado arotar en dirección opuesta, de forma que las moléculas circulares se enrollan sobre sí mismas. (B) Este problema lo resuelven las topoisomerasas, que catalizan la rotu- ra y la unión reversibles de las hebras de ADN. Las roturas transitorias introducidas por estas enzimas actúan como eslabo- nes giratorios que permiten a las dos he- bras de ADN rotar libremente una sobre otra. al ADN de hebra cesorias (proteínas de enganche deslizantes y proteínas de enganche de carga) que sitúan a la polimerasa en el cebador y mantienen su asociación estable con el molde (Fig. 5.8). Las proteínas de enganche de carga (llamadas el complejo ; en E. coli y factor de replicación C en eucariotas [RFC]) específicamente reconocen y se unen al ADN de la zona de unión entre el cebador y el molde. Las proteínas de enganche deslizantes(proteína ff en E. coli y antígeno nuclear de proliferación celular [PCNA] en eucariotas) se une adyacente a las proteínas de enganche de carga, formando un anillo alrededor del ADN molde. Las proteínas de enganche descargan después la ADN polimerasa en el ADN en la unión entre el cebador y el molde. El anillo formado por las de enganche deslizante mantiene la asociación de la polimerasa con su molde durante la replicación, permitiendo la síntesis ininterrumpida de miles de nucleótidos de ADN. Otras proteínas desenrollan la hebra molde de ADN y estabilizan regiones de una sola hebra (Fig. 5.9). Las helicasas son enzimas que catalizan el desen- rollamiento del ADN parental, emparejadas con la hidrólisis de ATP, a la cabeza de la horquilla de la replicación. Proteínas de unión al ADN monocatenario (p. ej., el factor de replicación A eucariota [RFA]) estabilizan la hebra molde de ADN desenrollada, manteniéndola en un estado de hebra única extendida para que sea copiada por la polimerasa. A medida que las hebras parentales se desenrollan, el ADN a la cabeza de la horquilla de replicación está siendo forzado a girar. Sin restricciones, esta rotación causaría que las moléculas de ADN circular (como el ADN de SV40 o el cromosoma de E. coli) se enrollaran sobre sí mismas, bloqueando eventual- mente la replicación (Fig. 5.10). Este problema lo resuelven las topoisomera- sas, enzimas que catalizan la rotura reversible y la unión de las hebras de ADN. Existen dos tipos de estas enzimas: Topoisomerasas de tipo | que rompen solo una hebra de ADN; topoisomerasas de tipo Il que introducen roturas simultá- neas en ambas hebras. Las roturas introducidas por los tipos | y Il de las topoi- somerasas sirven como ejes de giro que permiten a las dos hebras molde de ADN rotar o pivotar libremente alrededor de la otra de manera que la replicación puede continuar sin el enrollamiento del ADN a la cabeza de la horquilla (véase Fig. 5.10). Aunque los cromosomas eucariotas están compuestos por molécu- las de ADN lineares en lugar de circulares, su replicación también requiere to- de unión (A) € hi ——— np € > or —— Desenrollamiento SS del ADN parental PS ES 5 o Rotura transitoria SS que sirve como eslabón giratorio E permitir la NS a Enrollamiento de las hebras de ADN en la cabeza de la horquilla de replicación rotación libre de las hebras de ADN it 24, O AED OA 188 e Sección Il + Flujo de la información genética ES 3 E 5 Incorporación de G en lugar de A 3 5 3 Ss La polimerasa escinde la G mal apareada mediante su actividad exonucleasa 3 —> 5' 5 3 3 5 La síntesis procede con la incorporación de la base correcta (A) 5 3 a 5 Figura 5.12 Doble lectura de la ADN polimerasa. Se incorpora G en lugar de A como resultado de un mal apareamiento con T en la hebra molde. Debido a este mal apareamiento, la G del extremo 3' terminal no se une me- diante enlaces de hidrógeno a la hebra molde. Este error de emparejamiento en el extremo 3' de la cadena en crecimiento es reconocido y eliminado por la actividad exonucleasa 3'-5' de la ADN polimerasa, quien necesita para continuar la síntesis un cebador unido por puentes de hidróge- no a la hebra molde. Tras la escisión de la G desapareada, la síntesis de ADN conti- nua con la incorporación del nucleótido correcto (A). Fidelidad de replicación La exactitud de la replicación del ADN es crítica para la reproducción celular, y las estimaciones de mutación para una variedad de genes indican que la fre- cuencia de errores durante la replicación corresponde tan solo a una base inco- rrecta por cada 10* a 10" nucleótidos incorporados. Esta frecuencia de error es mucho menor que la predicha simplemente a causa del apareamiento de las bases complementarias. En particular, las diferencias de energía libre resultan- tes de cambios entre los enlaces de hidrógeno establecidos entre bases empa- rejadas correcta e incorrectamente, sólo son lo suficientemente grandes como para favorecer la formación de pares de bases emparejadas correctamente unas 1.000 veces. Como consecuencia, la selección de las bases determinada simplemente por los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, resul- taría en una frecuencia de error correspondiente a la incorporación de aproxi- madamente una base incorrecta por cada 10”. El alto grado de fidelidad real- mente alcanzado es el resultado de las actividades de la ADN polimerasa. Uno de los mecanismos por los que la ADN polimerasa aumenta la fidelidad de la replicación es ayudando a seleccionar la base correcta para la inserción en el nuevo ADN sintetizado. La polimerasa no solo cataliza la incorporación de cualquier nucleótido unido por un puente de hidrógeno a la hebra molde. En su lugar, discrimina activamente en contra de la incorporación de una base desa- pareada, presumiblemente mediante la adaptación de la conformación de un par de bases correcto. El mecanismo molecular responsable de la capacidad de las ADN polimerasas para seleccionar en contra de bases incorrectas aún no se ha descifrado, pero esta selección parece aumentar la exactitud de la replica- ción alrededor de cien veces, reduciendo la frecuencia de error esperada de 107* aproximadamente a 107? El otro mecanismo principal responsable de la exactitud de la replicación del ADN es la actividad de doble lectura de la ADN polimerasa. Como ya hemos dicho, la polimerasa | de E. colitiene una actividad exonucleasa 3' a 5'y 5'a 3”. La exonucleasa de 5' a 3' opera en la dirección de la síntesis de ADN y ayuda a eliminar los cebadores de ARN de los fragmentos de Okazaki. La exonucleasa de 3' a 5'opera en dirección opuesta a la síntesis de ADN, y participa en la doble lectura del nuevo ADN sintetizado (Fig. 5.12). La doble lectura es efectiva porque la ADN polimerasa necesita un cebador y no es capaz de iniciar la síntesis de novo. Los iniciadores que están unidos por puentes de hidrógeno al molde son los preferidos para su utilización, así que cuando una base incorrecta es incorpo- rada, se eliminará por la actividad de la exonucleasa 3' a 5' en lugar de continuar la síntesis. Tales actividades de las exonucleasas 3' a 5'también se encuentran asociadas a la polimerasa III de E. coli y a las polimerasas eucariotas d y ». Las exonucleasas 3' a 5'de estas polimerasas escinden selectivamente las bases de- sapareadas que han sido incorporadas al final de una cadena de ADN en creci- miento, por lo que aumenta la exactitud de la replicación de cien a mil veces más. La importancia de la doble lectura podría explicar el hecho de que las ADN polimerasas necesitan cebadores y que catalizan el crecimiento de las hebras de ADN solamente en el sentido 5' a 3”, Cuando el ADN se sintetiza en el senti- do 5' a 3', la energía necesaria para la polimerización se deriva de la hidrólisis del grupo 5“-trifosfato de un dNTP libre y es añadido al grupo 3'-hidroxilo de la cadena creciente (véase Fig. 5.2). Si el ADN se tuviera que extender en sentido 3' a 5', la energía de polimerización tendría que derivarse de la hidrólisis del grupo 5 -trifosfato del nucleótido terminal recién incorporado al ADN. Esto elimi- naría la posibilidad de la doble lectura, debido a que la eliminación de un nucleó- tido terminal desapareado también eliminaría al grupo 5'-trifosfato necesario como fuente de energía para la elongación de la cadena. Por tanto, aunque la capacidad de la ADN polimerasa para extender un cebador en sentido 5' a 3'pa- rece hacer a la replicación un proceso complicado, resulta necesario para ase- gurar la duplicación exacta del material genético. 24, O AED OA Capítulo 5 + Replicación, mantenimiento y reorganización del ADN genómico e 189 Combinada con la capacidad de discriminar en contra de la inserción de bases desapareadas, la actividad de doble lectura de las ADN polimerasas es suficiente para reducir la frecuencia de error de replicación a alrededor de una base desapareada por cada 10”. Mecanismos adicionales (discutidos en la sec- ción «Reparación del ADN») actúan para eliminar las bases desemparejadas que han sido incorporadas en el nuevo ADN sintetizado, asegurando así aún más la correcta replicación de la información genética Orígenes e iniciación de la replicación La replicación del ADN procariota y eucariota comienza en una única secuencia llamada origen de replicación, que sirve como un sitio específico de unión para proteínas que inician el proceso de replicación. El primer origen descrito fue el de E. coli, en cuyo análisis genético mostraba que la replicación siempre empezaba en un único sitio del cromosoma bacteriano. El origen de E. coli se ha estudiado en detalle y se sabe que se compone de 245 pares de bases de ADN, elementos que sirven como sitios de unión para las proteínas necesarias para iniciar la replicación del ADN (Fig. 5.13). El paso clave es la unión de una proteína iniciadora a secuencias específicas del ADN dentro del origen. La pro- teína iniciadora comienza desenrollando el origen del ADN y recluta a las otras proteínas implicadas en la síntesis del ADN. La helicasa junto con proteínas de unión al ADN monocatenario continúan desenrollando y presentando al ADN molde, y la primasa inicia la síntesis de las hebras conductoras. Se forman dos horquillas de replicación que se mueven en sentidos opuestos a lo largo del cromosoma circular de E. coli. El origen de la replicación en los virus de animales, como el SV40, se ha estudiado como modelo para la iniciación de la síntesis en eucariotas. SV40 presenta un solo origen de replicación (consiste en 64 pares de bases) que funciona tanto en células infectadas como en sistemas libres de células. La replicación comienza por una proteína codificada por el virus (llamada antígeno T) que se une al origen y que actúa como helicasa. Se requiere una proteína de unión al ADN monocatenario para estabilizar a la hebra molde desenrollada, y un complejo ADN polimerasa /-primasa comienza entonces la síntesis de ADN. Aunque resulta suficiente un solo origen para dirigir la replicación de geno- mas bacterianos y virales, se necesitan múltiples orígenes para replicar los ge- nomas más largos de las células eucariotas en un período de tiempo razonable. Por ejemplo, el genoma completo de E. coli (4 x 10* pares de bases) se replica partiendo de un solo origen en unos 30 minutos. Si los genomas de mamíferos (3 x 10* pares de bases) se replicaran a partir de un solo origen esto requeriría Figura 5.13 Origen de la replicación de E. colí. La replicación se inicia en un único sitio del cromo- soma de E. colí, denominado origen (011). El primer acontecimiento es la unión de una proteína iniciadora al ADN ori, que conduce el desenrollamiento parcial del molde. El ADN continúa desenrollándose debido a la acción de la helicasa y de las proteínas de unión al ADN de hebra simple, mientras que los cebadores son sintetizados por la primasa. Las dos horquillas de replicación formadas en el origen se mueven en direcciones opuestas a lo largo de la molécula de ADN circular, Cebador de ARN Ss Proteínas de unión Helicasa SF al ADN de hebra AA, ori Iniciador simple Sintesis de los cebadores de ARN — e ——> Unión de Desenrollamiento Formación de la proteína del ADN por dos horquillas iniciadora la helicasa y de replicación las proteínas de unión al ADN de hebra simple 24, O AED OA Capítulo 5 * Replicación, mantenimiento y reorganización del ADN genómico e 191 LEU2 Plásmido | | Células transformadas de levaduras Células transformadas de levaduras Se obtienen sólo células transformadas raras en las que el plásmido se ha integrado en el ADN cromosómico S. pombe carecen del sitio de unión claramente definido para ORC que poseen los elementos ARS de S. cerevisiae, pero contienen repeticiones de secuencias ricas en AT que parecen actuar como puntos de unión para el complejo ORC de S. pombe. Se ha encontrado que un origen de replicación de Drosophila abarca 2 kb de ADN y contiene varios puntos de unión de ORC, pero estas secuencias no se han definido. En mamíferos, algunos orígenes se han localizado en pocas kb de ADN. En otros casos, sin embargo, la replicación puede iniciarse en múlti- ples orígenes con grandes «zonas de iniciación» que abarcan de 10 a 50 kb. Así, parece que las secuencias que definen los orígenes de replicación varían mucho entre eucariotas, aunque el papel de las proteínas ORC como iniciado- res de replicación se encuentra altamente conservado. Telómeros y telomerasa: replicación de los extremos de los cromosomas Debido a que las ADN polimerasas sólo extienden los cebadores en sentido de 5' a 3', son incapaces de copiar los extremos 5' de las moléculas lineales de 24, O AED OA Placa en un medio carente de leucina Colonias de levaduras transformadas Obtención de numerosas células transformadas debido a que el plásmido se replica sin integración en el cromosoma Figura 5.15 Identificación de los orígenes de repli- cación en levaduras. Los plásmidos | y 111 contienen un gen marcador selectivo (LEU 2) que permite a las células transformadas crecer en un medio carente de leucina. So- lamente el plásmido 1! contiene un origen de replicación (ARS). La transformación de las levaduras con el plásmido | produce ex- clusivamente células transformadas raras en las que el plásmido se ha integrado en el ADN cromosómico. El plásmido 1, sin embargo, es capaz de replicarse sin la in- tegración en el cromosoma de la levadura (replicación autónoma), de manera que se obtiene un número mayor de células trans- formadas a partir de su introducción en las células de levaduras. 19 e Sección Il + Flujo de la información genética Figura 5.16 Elemento ARS de levaduras. El ele- mento contiene una secuencia consenso ARS de 11 pares de bases (ACS), que es el sitio de unión específico para el comple- jo del origen de replicación (ORC). Otros tres elementos adicionales (B1, B2 y B3) que individualmente no son esenciales, contribuyen a la función de ARS. ADN (AT)TITA(TICNA/G)TTT(AT) ADN. Como consecuencia, se requieren mecanismos especiales para replicar las secuencias terminales de los cromosomas lineales de las células eucario- tas. Estas secuencias (telómeros) se componen de repeticiones en tándem de secuencias simples de ADN (véase Cap. 4). Son replicadas por la acción de una enzima única llamada telomerasa, que es capaz de mantener a los telómeros catalizando de su síntesis en ausencia de una hebra molde de ADN. La telomerasa es una transcriptasa inversa, una de las clases de las ADN polimerasas, descubiertas por primera vez en retrovirus (véase Cap. 3), que sintetizan ADN a partir de un molde de ARN. Cabe destacar que la telomerasa porta su propio molde de ARN, que es complementario a las secuencias repeti- das de los telómeros, como parte del complejo enzimático. El uso de este ARN como molde permite a la telomerasa generar múltiples copias de las secuencias repetidas teloméricas, manteniendo por tanto a los telómeros en la ausencia de un molde de ADN convencional para dirigir su síntesis. El mecanismo de acción de la telomerasa fue descubierto en 1985 por Carol Greider y Elisabeth Blackburn con los estudios del protozoo Tetrahy- mena (Fig. 5.17). La telomerasa de Tetrahymena está unida a un ARN de 159-nucleótidos de longitud que incluye la secuencia 3'-AACCCCAAC-5". Esta secuencia es complementaria a la repetición telómerica de Tetrahymena (5'-TTGGGG-3' y sirve como molde para la síntesis del ADN telomérico. La utilización de este ARN como molde permite a la telomerasa extender el extremo 3' del ADN cromosómico una unidad de repetición detrás de su longi- tud original. La hebra complementaria puede ser entonces sintetizada por el complejo polimerasa y-primasa utilizando como iniciador al ARN convencional. La eliminación de los ARN cebadores deja un extremo 3' del ADN cromosómico suelto, que puede formar lazos al final de los cromosomas eucariotas (véase Fig. 4.22). La telomerasa ha sido identificada en una gran variedad de eucariotas, y los genes codificadores de los ARN de ésta se han clonado en Tretahymena, levadu- ras, ratones y humanos. En cada caso, el ARN de la telomerasa contiene secuen- cias complementarias a la secuencia telomérica repetida de este organismo (véase Tabla 4.3). Además, la introducción de genes mutantes del ARN de la telomera- sa en levaduras han dado como resultado alteraciones correspondientes a las secuencias cromosómicas teloméricas repetidas, demostrando directamente la función de la telomerasa en el mantenimiento de los extremos de los cromoso- mas eucariotas. Reparación del ADN El ADN, como cualquier otra molécula, es capaz de participar en diversas reac- ciones químicas. Debido a que sólo el ADN sirve de copia permanente del geno- ma celular los cambios en su estructura tienen más transcendencia que altera- ciones en otros componentes celulares, como el ARN o las proteínas. Las mutaciones pueden surgir de la incorporación de bases incorrectas durante la replicación del ADN. Además, se producen diversos cambios bien espontáneos 24, O AED OA