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Replicación, reparación y recombinación La replicación del ADN tiene como objetivo producir dos células hijas con el material genético idéntico, de tal forma que resulta necesario reparar los cambios inducidos (mutaciones) durante el mismo proceso o a consecuencia de agentes externos (físicos, químicos). Aún así, la acumulación de mutaciones a lo largo de miles de años resulta en la mejora de los mecanismos celulares que favorecerán a la especie, aunado a esto, el intercambio de segmentos génicos de mayor tamaño (recombinación) permite que los organismos mejoren su adaptación asegurando su supervivencia en un medio que también se encuentra en recambio constantemente. Por lo que generalmente, se reconoce que los cambios en los genomas que prevalecen (a largo plazo) favorecen los procesos evolutivos. En comparación con los procariotas, la tasa de mutación en eucariotas (como el humano) es extremadamente baja, de aproximadamente 1 por cada 1010 nt por división celular, considerando que las mutaciones letales son ausentes en la progenie (en bacterias es 3 por cada 1010 por generación celular). ¿Existen diferencias con respecto a los mecanismos de reparación? Sí, ¿cuáles?. También se debe considerar que pocas de las células germinales (sexuales) de un mamífero se fertilizan, por lo que desde el punto de vista evolutivo, la acumulación de mutaciones en la especie es aún menor. ¿Cuál es el impacto de las mutaciones en las células germinales y somáticas? *Recuerda: las células las somáticas contienen2 n material genético, las células germinales (sexuales) n. Las mutaciones perjudiciales que ocurran en el ADN de las células germinales se conservarán en la progenie. En el caso de las somáticas las mutaciones podrían ser
responsables de generar “variantes locales”, y contribuir al desarrollo de patologías como el cáncer. Por lo que resulta necesario que la célula mantenga la integridad de los genes (estabilidad germinal y somática), que lleva a cabo a través de la alta fidelidad con la cual las secuencias de ADN son replicadas y preservadas. Replicación En este apartado se discutirá cómo la maquinaria de replicación tiene la capacidad de duplicar el ADN con exactitud y una velocidad de 1000 nt por segundo. La doble hélice del ADN se utiliza como plantilla para sintetizar las nuevas cadenas, de forma que los desoxinucleótidos (base nitrogenada-desoxiribosa-trifosfato) son adicionados por complementariedad por la ADN polimerasa (ADNPol), lo que genera dos cadenas cuyas hebras comprenden una “nueva” y una “vieja”, dicho esto, la replicación es semiconservadora. Asimismo, las interacciones químicas que deben formarse son: 1) los puentes de H entre las bases nitrogenadas y 2) los enlaces fosfodiéster entre la desoxiribosa el grupo PO4-2 en el esqueleto del ADN. Esta reacción de polimerización toma lugar en la horquilla de replicación, donde se ensamblan un gran número de proteínas con funciones específicas en cada una de
El segundo mecanismo es la corrección de exonucleótidos, que ocurre inmediatamente después de que (en raras ocasiones) se adiciona un nt incorrecto. Las ADNPol son muy estrictas con respecto a las cadenas que elongan: requieren un extremo 3’-OH en la cadena del cebador ( primer ). Las moléculas con el apareamiento incorrecto en el extremo 3’-OH del cebador no son tan efectivos como las plantillas debido a que tienen dificultad extendiéndolas. La ADNPol corrige tal error a través de un sitio catalítico (ya sea en una subunidad o dominio separados de la enzima). Este mecanismo de corrección elimina cualquier residuo mal apareado o no apareado en el término del cebador, continuando hasta que se remuevan los nt suficientes para regenerar el extremo 3-OH’ que pueda iniciar la síntesis de ADN. De esta forma la enzima se “auto-corrige” removiendo sus propios errores durante la polimerización conforme se traslada a lo largo del ADN. La propiedad de autocorrección depende del requerimiento de un primer perfectamente apareado, además de que no es posible iniciar la síntesis de novo sin este cebador. Por otro lado las
ARNPol que participan en la transcripción no requieren de dicho mecanismo de corrección: los errores que ocurren durante la síntesis del ARN no pasan a la siguiente generación, y la molécula de ARN ocasionalmente defectuosa producida no tiene significancia a largo plazo, por tanto las ARNPol pueden iniciar la síntesis sin un cebador. La frecuencia de error es de aproximadamente uno por cada 10^4 eventos tanto el la síntesis de ARN como en la traducción de mARN a polipéptidos, alrededor de 100,000 veces mayor que en la replicación del ADN. Mecanismo de replicación A continuación se describe las funciones de las proteínas que participan en la horquilla de replicación. Primero toma lugar la primasa , una enzima que sintetiza el cebador de ARN (»10 nt) sobre las monocadenas, lo que da lugar a una doble hélice híbrida ADN-ARN, en el caso de la cadena líder sólo se necesita un cebador, mientras que para la cadena retrasada uno por cada fragmento de Okazaki. En éste último caso se genera un extremo 3’-OH, haciendo posible la elongación por parte de la ADNPol en los fragmentos de Okazaki. La síntesis de estos fragmentos termina cuando la ADNPol se encuentra con el extremo 5’ de cada fragmento previo. Posteriormente, para procurar la continuidad de la cadena de ADN, un sistema de reparación actúa para eliminando el cebador y reemplazándolo con ADN. Entonces la enzima ligasa une el extremo 3’ al 5’ del fragmento previo para completar el proceso. Finalmente la ADN ligasa sella los fragmentos catalizando la síntesis de un enlace fosfodiéster con inversión de ATP (hidrólisis), que usa para activar el extremo 5’ para dar paso a la formación del enlace. ¿No sería preferible utilizar un cebador de ADN que no necesite ser eliminado, en lugar de ARN? La respuesta es que una Pol con actividad de autocorrección no puede iniciar la síntesis de novo. Si la primasa sintetizara el cebador de ADN, no se requeriría la actividad de autocorrección por lo que la fidelidad de la replicación se vería comprometida, más aún la primasa que sintetiza en los fragmentos de Okazaki realizaría una copia más inexacta (al menos 1 por cada 10^5 ), lo que resultaría en un
Otra proteína de gran importancia es la Abrazadera. Por sí mismas, las ADNPol sólo sintetizan unos cuantos nt antes de disociarse de la plantilla, esto permite que la ADNPol que está sintetizando un fragmento de Okazaki en la cadena retrasada sea reutilizada. Sin embargo su rápida puede dificultar la síntesis de fragmentos largos, por lo que es necesaria una proteína accesoria que actúa como abrazadera deslizante (PCNA). Esta proteína con su forma de anillo, procura la permanencia de la Pol sobre el ADN conforme se mueve a lo largo de la plantilla, localizada por detrás de la ADNPol, y se desliza a lo largo de la cadena mientras la Pol añade nt, y la libera al entrar en contacto con una dsADN. El ensamblaje de la abrazadera se realiza por la proteína cargadora de la abrazadera , proceso que hidroliza ATP mientras carga a la abrazadera en la unión plantilla-cebador. En la cadena líder, la ADNPol se encuentra fuertemente unida a la abrazadera permaneciendo asociadas por mucho tiempo, mientras que en la retrasada la asociación-disociación tanto al ADN como a la abrazadera, ocurre cada vez que inicia con un fragmento.
Al final, todas estas proteínas forman complejo multienzimático que sintetiza al ADN rápidamente conocido como horquilla de replicación , en resumen:
- Al frente de la horquilla de replicación, la helicasa abre la doble hélice.
- Dos ADNPol actúan en la horquilla, una en la líder y una en la retrasada. En la líder la síntesis es continua mientras que en la retrasada debe reiniciar en pequeños intervalos. De esta forma la enzima se “auto-corrige” removiendo sus propios errores durante la polimerización conforme se traslada a lo largo del ADN. La propiedad de autocorrección depende del requerimiento de un primer perfectamente apareado, además de que no es posible iniciar la síntesis de novo sin este cebador. Por otro lado las ARNPol que participan en la transcripción no requieren de dicho mecanismo de corrección: los errores que ocurren durante la síntesis del ARN no pasan a la siguiente generación, y la molécula de ARN ocasionalmente defectuosa producida no tiene significancia a largo plazo, por tanto las ARNPol pueden iniciar la síntesis sin un cebador. La frecuencia de error es de aproximadamente uno por cada 10^4 eventos tanto el la síntesis de ARN como en la traducción de mARN a polipéptidos, alrededor de 100,000 veces mayor que en la replicación del ADN. Mecanismo de replicación
Para que la síntesis proceda, la doble hélice debe abrirse al frente de la horquilla de replicación, y así hacer posible el apareamiento de los desoxinucleótido trifosfato. Sin embargo la hélice es muy estable bajo condiciones fisiológicas, de tal forma que se requieren altas temperaturas (cercana al punto de ebullición del agua para separarlas, en un tubo de ensaye). Debido a esto, son necesarias dos proteínas que “abran” y estabilicen las monocadenas para continuar la replicación. La helicasa y las proteínas de unión a las cadenas individuales del ADN (SSB). La helicasa hidroliza ATP al unirse al ADN, lo que ocasiona un cambio conformacional en la proteína a una forma cíclica para funcionar como una “propela” sobre sí misma en una cadena sencilla de ADN, abriendo la hebra con una velocidad de hasta 1000 nt por segundo Por otro lado las proteínas SSB (o desestabilidadoras de la hélice) se unen fuertemente para exponer las monocadenas sin cubrir las bases y que estén disponibles como plantilla. Estas proteínas son incapaces de unirse a una
doble hélice, pero auxilian a las helicasas estabilizando las cadenas. Asimismo a través de la cooperación, recubren y fortalecen las regiones simples (ssADN) que pueden presentarse en la plantilla de la cadena retrasada, previniendo la formación de bucles, que si no son removidas, pueden impedir la polimerización.
Otra proteína de gran importancia es la Abrazadera. Por sí mismas, las ADNPol sólo sintetizan unos cuantos nt antes de disociarse de la plantilla, esto permite que la ADNPol que está sintetizando un fragmento de Okazaki en la cadena retrasada sea reutilizada. Sin embargo su rápida puede dificultar la síntesis de fragmentos largos, por lo que es necesaria una proteína accesoria que actúa como abrazadera deslizante (PCNA). Esta proteína con su forma de anillo, procura la permanencia de la Pol sobre el ADN conforme se mueve a lo largo de la plantilla, localizada por detrás de la ADNPol, y se desliza a lo largo de la cadena mientras la Pol añade nt, y la libera al entrar en contacto con una dsADN. El ensamblaje de la abrazadera se realiza por la proteína cargadora de la abrazadera , proceso que hidroliza ATP mientras carga a la abrazadera en la unión plantilla-cebador. En la cadena líder, la ADNPol se encuentra fuertemente unida a la abrazadera permaneciendo asociadas por mucho tiempo, mientras que en la retrasada la asociación-disociación tanto al ADN como a la abrazadera, ocurre cada vez que inicia con un fragmento. Al final, todas estas proteínas forman complejo multienzimático que sintetiza al ADN rápidamente conocido como horquilla de replicación , en resumen:
- Al frente de la horquilla de replicación, la helicasa abre la doble hélice.
- Dos ADNPol actúan en la horquilla, una en la líder y una en la retrasada. En la líder la síntesis es continua mientras que en la retrasada debe reiniciar en pequeños intervalos. La asociación entre todas estas proteínas incrementa la eficiencia de la replicación, y también facilita la carga de la abrazadera de la Pol cada vez que se sintetizan los fragmentos de Okazaki. Las proteínas interactúan entre ellas en una gran subunidad (MM > Da), permitiendo la síntesis en ambos lados de la horquilla de una forma coordinada y eficiente. Existe otro mecanismo de reparación conocido como reparación de errores de apareamiento por escisión que se describió inicialmente en procariotas, este sistema detecta distorsiones potenciales en la hélice debido a las uniones irregulares entre bases no complementarias, estas distorsiones ocurren por la presencia de formas tautoméricas de las bases, por ejemplo metilaciones. E. coli lleva a cabo la metilación de la cadena recién sintetizada, lo que les permite ser identificadas como nacientes. Este proceso involucra el reconocimiento de la cadena recién sintetizada, la escisión de la porción que contiene el apareamiento incorrecto y la re-síntesis del segmento eliminado usando la cadena vieja como plantilla. Este sistema reduce los errores de replicación en un factor adicional de 100 a
Los eucariotas utilizan un sistema de identificación distinto, en el que la cadena retrasada recién sintetizada presenta roturas transitorias (antes de ser selladas por la ligasa), que proveen la señal que dirige tal mecanismo de corrección en la cadena apropiada. Esto
el enmarañado durante o después de la replicación (p. ej. al separar el material replicado).
Las secuencias OriP deben contener: 1) un sitio de unión para el complejo iniciador ORC (complejo de reconocimiento de Ori), un fragmento rico en A y T y 3) al menos un sitio de unión para las proteínas facilitadoras de unión del ORC, que probablemente ajuste la estructura de la cromatina. ¿Cómo saber en qué Ori iniciar, teniendo tantos, y asegurar que el ADN sólo se copie una vez? Durante G1, las helicasas son cargadas al ADN junto al ORC para crear un complejo pre- replicativo. Con el paso de G1 a S, se reclutan cinasas especializadas que activan a las helicasas, la apertura del ADN y el ensamblaje de la horquilla. Estas cinasas previenen el ensamblaje de nuevos complejos pre-replicativos hasta que se reinice la fase M y con ello todo el ciclo celular, esto lo llevan a cabo fosforilando ORC, evitando la interacción con nuevas helicasas.
