Alumnos:Ojeda Gisela, Herbas M. José, Aquino Federico
Fecha: 11/11
Profesor: Gudiño Esteban
Materia: TAS
Purificación de proteínas
Proteína asignada N°25
Estabilidad de la proteína: la actividad enzimática de la proteína 25 es estable durante
varias horas a temperatura de hasta 50 °C y a valores de pH de entre 3,5 y 11,0.
Introducción :
Las técnicas para purificar una proteína se determinan a partir de una o varias propiedades
como la carga, el peso molecular, la hidrofobicidad, la especificidad por algún ligando.
En este trabajo se describen, de manera general las etapas y técnicas utilizadas para la
purificación de la proteína 25.
Técnicas utilizadas
Electroforesis en gel (PAGE ) :
El método utiliza dos características de las proteínas para poder separarlas, su carga neta
(utilizando la técnica de enfoque isoeléctrico) y su tamaño (utilizando la técnica SDS-
PAGE). Este método permite estimar el punto isoeléctrico (pI), el pH al cual la proteína tiene
carga neta cero y el peso molecular (Mr) de la proteína de interés. Está se utilizó para ver
cómo la proteína fue aislada. En la imagen 1 se observa que la proteína tiene un pH de 7,5
y un Mr de 700 D aproximado.
Cromatografía de intercambio iónico :
Este método depende de las diferentes cargas netas de las proteínas. Consiste en una
columna que contiene una matriz insoluble que puede tener carga neta positiva o negativa
según el tipo de resina. El buffer inicial va a determinar la carga de la proteína y debe tener
un pH cercano al punto isoeléctrico de la proteína de interés.
Cromatografía de afinidad :
Es una técnica donde para la separación de macromoléculas solubles, se utiliza una fase
estacionaria diseñada para interaccionar específicamente con el material deseado,
retrasando de este modo su elución.
La unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un
soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las
moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se unen
avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados
cambiando las condiciones de la fase móvil.
Resultados y conclusión
En una primera etapa se aplicó la técnica de cromatografía de intercambio iónico, la
columna tiene carganeta positiva,dónde el medio iónico fue la S-Sepharosa y se
agrega un buffer de Ph7,6 , entonces los grupos de la resina van a quedar
enlazados a aniones, y que luego van a ser intercambiados por la carga negativa
de la proteína. En la imagen 3 se aísla la fracción que contiene la actividad
enzimática.
Luego se aplica una cromatografía de afinidad, dónde se obtiene una buena
purificación a bajo costo y un buen rendimiento.
Entonces, combinando las distintas técnicas de cromatografía iónica y de afinidad,
es posible aislar a mi analito de interés, obteniendo así mi proteína con la mayor
pureza y un bajo costo.
