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Asignatura: Microbiología 2
1. Título práctica de laboratorio:
TINCIONES DE MICROORGANISMOS
Integrantes: Código:
2. OBJETIVOS
General Realizar diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares de bacterias.
Específicos: Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos empleando técnicas de tinción simple y diferencial. Aplicar en el laboratorio, principios teóricos de tinción para el reconocimiento de células y estructuras procariotas Comprender la importancia de las buenas prácticas de laboratorio y aplicación de normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.
3. REFERENTES CONCEPTUALES
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas así como en la identificación de microorganismos habitantes de diferentes ecosistemas. Existe una gran variedad de tinciones que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, la tinción de Wright utilizada para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo de la parasitología y la de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis. En el caso de la identificación de componentes estructurales de hongos la coloración con azul de lactofenol es la más utilizada (1).
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La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis coloreado, lo que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsula o endosporas (2).
Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o ácido, por ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+^ y eosinato-. Cuando el ion coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro (-) y azul de metileno (+) (3). Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de metileno+^ reemplaza al catión Na+^ de las células dándoles color (3).
Según la estructura que el colorante tiña en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en: coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de un colorante y con la misma coloración, las células se tiñen de manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas, glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).
En la práctica de tinciones los estudiantes realizarán técnicas simples: tinción con azul de metileno y diferenciales: Gram para diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-), teniendo en cuenta la composición química de la pared celular (peptidoglucano). Tinción de Shaeffer Fulton para el reconocimiento de endosporas y, en el caso de capsulas bacterianas, la coloración negativa (4).
La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. Se fundamenta en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias (Figura 1). La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloración es un criterio de clasificación
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5. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
MATERIALES (Grupo 3 o 4 de estudiantes)
REACTIVOS (Grupo 25 estudiantes)
EQUIPOS (Grupo 25 estudiantes) 1 caja de Escherichia coli 1 caja de Bacillus spp. 2 asa redonda
Frasco gotero con 20ml Solución salina fisiológica NaCl 0.9% Gotero con 5ml de Aceite de inmersión Frasco gotero con 10ml de líquido para limpieza de lentes Frasco gotero con 20ml con Colorantes de Gram Frasco gotero con 20ml de Verde malaquita Frasco gotero con 20ml de Azul de metileno
1 microscopio 1 mechero
Materiales que debe traer el estudiante Elementos de bioseguridad 10 Láminas portaobjeto 10 Láminas cubreobjetos Toallas desechables 1 Encendedor 1 Lápiz de cera o marcador indeleble Frasco de tinta china Lápices de colores
6. PROCEDIMIENTO
La práctica se divide en dos partes que se desarrollaran a criterio del docente.
PARTE A Caracterización macroscópica: A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características macroscópicas que observa. Describa la morfología bacteriana usando las siguientes características (7,8)
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Forma (^) Elevación (^) Borde
Consistencia (probarla con el asa) y textura
La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar.
Superficie
Puede ser uniformemente brillante y suave o estriada con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa
Pigmentación (color)
Esta característica es muy común en las bacterias saprófitas (rojas, anaranjadas, amarillas, etc). De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado.
Características ópticas luz transmitida (observar a través de la colonia)
Opaca: No permite el paso de luz Traslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a través de la colonia. Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a través de la colonia
Figura 2. Forma, elevación y bordes de colonias bacterianas.
Realización de frotis
- A partir de medio líquido: cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma circular de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis).
- A partir de un medio sólido: ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl 0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña cantidad de bacterias de
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Figura 3. Procedimiento tipos de coloración
Figura 4. Morfología microscópica bacteriana (8)
Coloración simple (^) Coloración de Gram
Coloración negativa Coloración endospora
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PARTE B
Coloración de Shaeffer-Fulton para endospora (Tinción diferencial) Procedimiento (Figura 3): ● Realice el montaje del cultivo Bacillus spp y fíjelo al calor. ● Cubra con verde de malaquita y caliente durante 5 minutos hasta emisión de vapores, sin que la preparación llegue a secarse. Adicione más colorante cuando se esté secando. ● Deje enfriar la lámina por 1 ó 2 minutos. ● Lave con agua de llave por 30 segundos. ● Cubra la preparación con safranina o fucsina de Gram por 30 segundos. ● Lave, escurra, limpie el reverso de la lámina, deje secar. ● Observe al microscopio con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Coloración con tinta china (coloración negativa) Procedimiento (Figura 3): ● Coloque una gota de tinta china sobre un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo de Klebsiella spp. formando un extendido sobre la lámina. ● Deje secar al aire y fije brevemente con calor. ● Lave suavemente y sin flujo directo del agua de la llave para evitar perder el extendido. Escurra y seque el frotis. ● Observe con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Disponga las láminas utilizadas en el recipiente rotulado como “Descarte de láminas”
7. BIBLIOGRAFÍA
1. López-Jácome, L.E. Hernández-Durán, M.; Colín-Castro, C A, Ortega-Peña, S. Cerón-González, G. Franco-
Cendejas, R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología Artículo de revisión: [edición online]. 2014; Vol 3, No. 1 [9 páginas]. Accesible en URL: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf Consultada el 25 de Enero de 2015.
2. Negroni M. El diagnóstico en clínica estomatológica. 2ª Edición. Buenos Aires. Editorial Médica
Panamericana.
3. Escobar de Rico M. Prácticas de laboratorio: fundamentos de miCrobiologia. Santafé de Bogotá. Centro
Editorial Javeriano. CEJA.1998.
4. Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologia medica. 26ª Edición. Editorial Mc Graw Hill. 2014. P 11-
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INFORME DE LABORATORIO
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TABLA DE RESULTADOS (1.5/5.0):
Con los resultados obtenidos y observaciones durante el desarrollo de la práctica, complete las siguientes tablas de resultados. Utilice cada uno de los círculos para realizar los dibujos de sus observaciones, tenga en cuenta al realizar sus dibujos utilizar el color correspondiente a las células coloreadas.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS (2.0/5.0) Realice un análisis, correlacionando los resultados obtenidos y los conceptos teóricos que soportan la práctica. La discusión de resultados tiene un componente altamente teórico y es necesario que la información que soporte esta sección sea citada y verificada en función de utilizar las referencias pertinentes para el caso. En su análisis resuelva:
- ¿Por qué se observan diferencias en coloración entre las cepas analizadas por tinción de Gram y no se observan con la tinción simple de azul de metileno?
- Explique cómo se verían las células bacterianas en el procedimiento de tinción de Gram si se cometieran los siguientes errores: a. Incubar el decolorante demasiado tiempo b. Incubar el decolorante poco tiempo c. No fijar por calor antes de teñir
- ¿De qué color se observarían las esporas si no se calienta el verde de malaquita?
- ¿Cuáles son las aplicaciones de las tinciones utilizadas?
- ¿Qué se tiñe y que no se tiñe en la tinción de cápsula?
CONCLUSIONES (1.0/5.0) Presente la conclusión en forma de un único párrafo en el que se incluya los hallazgos de la práctica con su respectiva justificación teórica, y las habilidades personales adquiridas durante el desarrollo del
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laboratorio como aporte al ejercicio profesional.
BIBLIOGRAFÍA (0.5/5.0) Ingrese la lista de referencias utilizadas para la resolución del informe. Organícelas de acuerdo a las normas VANCUOVER.
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COLORACIÓN DE
GRAM
Nombre del microorganismo 1:
Nombre del microorganismo 2 :
Magnificación:
Forma Arreglos Color Reacción a la coloración (positiva/negativa)
COLORACIÓN DE ENDOSPORAS Nombre^ del microorganismo:
Magnificación:
Color de las esporas Color células vegetativas Localización de la endospora
