Presentacion de Técnicas de Hibridación, Diapositivas de Biología Molecular

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Técnicas de

hibridación

¿Qué es la hibridación?

Es una técnica de detección de ácidos nucleicos (componentes del ADN).

¿Cómo funciona?

Se generan hebras de ADN monocatenario, llamadas “sondas”, complementarias a la secuencia buscada, para determinar si la muestra analizada contiene efectivamente el segmento de ADN que queremos encontrar.

¿Cómo preparo al ADN para las técnicas?

1. Desnaturalización del ADN para obtener dos hebras (ADN monocatenario).
2. Unión del ADN monocatenario a la sonda. La sonda permite la detección del ADN por métodos colorimétricos y/o radiactivos.

Técnicas de

hibridación básica

Southern Blot

Detección de ADN por sondas de ADN. Cualitativa.

1. Extracción de ADN.
2. Corte con enzimas de restricción (cortan en sitios de restricción).
3. Electroforesis; separación de fragmentos de ADN por carga y tamaño molecular. I. Se siembra el ADN cortado en gel de agarosa y se lo somete a cargas eléctricas para separarlo por tamaño y carga. II. Una vez migrado, el ADN se somete a Hidróxido de Sodio; desnaturaliza al ADN. III. Para ver las bandas en el gel se usa Bromuro de Etidio.
4. Transferencia (se mueve el ADN del gel a una membrana de nitrocelulosa).
5. Hibridación. Exposición del ADN a la sonda; se deja incubar una noche, se lava y se busca la hibridación con Rayos X.
   • Mediante los rayos X se obtiene lo llamado “autorradiograma”.

Northern Blot

Detección de ARNm por sondas de ADN. Evalúa la expresión génica.

1. Aislamiento del ARN (puede ser total o mensajero).
2. Generación de la sonda a partir del ARN obtenido.
3. Electroforesis en gel de agarosa desnaturalizantes.
   • ¿Por qué necesito que el gel sea desnaturalizante? Porque el ARN tiende a aparearse a sí mismo.
4. Transferencia a una membrana.
5. Hibridación.
6. Lavados.
7. Detección por rayos X.

Northern Blot

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Northern-blot

Western Blot

Comparación de técnicas

ARRAYS

Existen varios tipos de arrays:

• De ADN:
  • Microarrays.
  • Gene-Chip.
  • Chips Microelectrónicos.
  • Macroarrays.
• De tejidos. Se hace sobre muestras en bloques de parafina, teñidas previamente. Array = micro disposición. Conjunto de sondas moleculares, fijas en un soporte, en posiciones específicas y conocidas. ¿De qué pueden ser las sondas? De ADN; productos de PCR u oligonucleótidos sintéticos. ¿Cómo es el soporte? Un “portaobjetos” con pocillos; en cada pocillo hay una sonda específica a un gen.

Microarrays

Similar al Northern Blot. Diferencias:

• Sonda fija al soporte.
• Muestra marcada.
• Se usa más de una sonda, para detectar más de un gen.
• Puede evaluar la expresión de varios genes de varias muestras. ¿Qué ventajas nos ofrece esto? Obtenemos más información en menos tiempo, y es menos laborioso.

Microarrays

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Tecnología-de-microarrays-chips-de-ADN-o-ARN

Microarrays - Aplicaciones

• Detección de mutaciones y polimorfismos.
• Secuenciación.
• Diagnóstico clínico.
• Screening y toxicología de fármacos:
  • Farmacogenómica. Asociación entre el perfil génico y la respuesta terapéutica a drogas.
  • Toxicogenómica. Evaluar cambios frente a sustancias tóxicas.
• Seguimiento de terapia.
• Medicina preventiva.
• Hibridación comparativa del genoma.
• Inmunoprecipitación de la cromatina.

Tratamiento con Bisulfito

Evaluación de la epigenética del ADN; expresión génica según la metilación del ADN. ¿Dónde se metila el ADN? En islotes CPG; ricos en Citocina y Guanina. Los metilos se unen principalmente a Citocinas. ¿En qué se basa el tratamiento con bisulfito?

1. Se expone a una muestra de ADN metilado a bisulfito; este convierte las citocinas NO metiladas en uracilo.
2. Se hace una PCR del ADN tratado, dirigida a los fragmentos de regiones promotoras de los genes a evaluar.
3. Secuenciación del resultado:
   • Si se encuentra citocina, los islotes estaban metilados; NO se expresaban.
   • Si se encuentra uracilo, los islotes NO estaban metilados; estaban expresados.

Tratamiento con Bisulfito