Preguntas PCR Molecular, Ejercicios de Biología Molecular

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PREGUNTAS PCR Evelyn Scarlett Jiménez Angulo 4C 27/04/ LABORATORIO

MATERIA:

BIOLOGÍA

MOLECULAR

Y GENÉTICA

Profesor: Dra.

Blanca

Eunice

Gonzales

PREGUNTAS PCR

1. ¿Qué es la Reacción de Cadena de la Polimerasa (PCR)? R: Es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada. Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la secuencia en estudio en sólo unas pocas horas. 2. ¿Qué es un Amplicon? R: Conjunto de moléculas de ADN idénticas, resultado de una reacción de cadena polimerasa, esencialmente se trata de un clon molecular. Es una herramienta para diseñar cebadores de PCR donde se pueden evaluar grupos de secuencias de ADN relacionadas en forma alineada. 3. ¿Qué ocurre en las etapas de Desnaturalización, Alineación y Extensión? R: DESNATURALIZACIÓN: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de guanina y citosina que contenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR: A continuación, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. EXTENSIÓN O ELONGACIÓN DE LA CADENA: En esta etapa actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso

R: Son nucleótidos que sirven para generar las nuevas cadenas de ADN. Los dNTP que se usan en la replicación del ADN contienen tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5' de la desoxirribosa y dependiendo de la base nitrogenada serán dATP, dTTP, dCTP o dGTP.

10. ¿Para qué sirve el Tampón y el Cloruro de Magnesio? R: TAMPÓN Es una disolución que es capaz de regular el pH , es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se produzca CLORURO DE MAGNESIO: Es un cofactor necesario para la actividad enzimática de las DNA polimerasas. La concentración óptima de MgCl2 debe determinarse empíricamente para cada polimerasa, secuencia y par de cebadores. Demasiado poco o mucho puede reducir la eficiencia de amplificación o generar productos inespecíficos, respectivamente. 11. ¿Qué es la Polimerasa y de dónde se obtiene? R: Producen el ADN nuevo, estas requieren de un molde y de un cebador (iniciador), y sintetizan ADN en dirección 5' a 3'. Durante la replicación del ADN, una de las cadenas nuevas (la cadena líder) se produce como un fragmento continuo. Micropipetas La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para medir la alícuota de un líquido con bastante presión y transferir volúmenes pequeños

de líquidos para el manejo de las distintas técnicas científicas. Los volúmenes de las micropipetas varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está

laboratorio empleado para medir la alícuota de un líquido con bastante presión y transferir volúmenes pequeños de líquidos para el manejo de las distintas técnicas científicas. Los volúmenes de las micropipetas varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente.

Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar

varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas,

en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas, absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Micropipetas La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para medir la alícuota de un líquido con bastante

un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas, absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Micropipetas

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para medir la alícuota de un líquido con bastante presión y transferir volúmenes pequeños de líquidos para el manejo de las distintas técnicas científicas. Los volúmenes de las micropipetas varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y

acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas, absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. (1) Cornide M.T., DIVERSIDAD GENETICA Y MARCADORES MOLECULARES. CNIC, La Habana, 2000 (2) Tautz D., HYPERVARIABILITY OF SIMPLE SEQUENCES AS A GENERAL SOURCE FOR POLYMORPHIC DNA MARKERS. Nucleic Acids Research 17, 6463-6471. 1989 (3) Mullis K.B., THE POLYMERASE CHAIN REACTION, Birkhauser, Boston 1994 (4) Dellaporta S.L., Wood J. And Hicks J.B., A PLANT DNA MINIPREPARATION: VERSION II. Plant Molecular Biology Reprter 1(14):19-21, 1983 Micropipeta (2010). MICROPIPETAS (OPERACION Y MANEJO). 05/02/2019, de Equipos y laboratorios de Colombia Sitio web:

https:// www.equiposylaboratorio.c om/sitio/ contenidos_mo.php? it= (2011). Micropipetas y pipetas. 05/02/2019, de PCE intstruments Sitio web: https://www.pce- iberica.es/instrumentos-de- medida/instrumentos- laboratorios/ equipos-laboratorios/ pipetas.ht