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Una práctica de laboratorio realizada por estudiantes de ingeniería química de la universidad del istmo (unistmo) sobre la creación de una curva de calibración utilizando un espectrofotómetro uv. El documento incluye una introducción sobre la importancia de la espectrofotometría, los fundamentos teóricos de la ley de beer y los parámetros de control, así como la metodología seguida para la preparación de las soluciones y la obtención de la curva de calibración. Se presentan los cálculos realizados, los resultados obtenidos en forma de gráficas y tablas, y finalmente, una conclusión sobre la importancia de esta práctica para desarrollar habilidades técnicas y confianza en el manejo de equipos uv. Este documento podría ser útil para estudiantes de ingeniería química, química analítica o áreas afines, como material de estudio, resumen o práctica de laboratorio.
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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CURVA DE CALIBRACIÓN CON
ESPECTROFOTOMETRO UV
INTRODUCCIÓN
El espectrofotómetro tiene la importancia para complementar los análisis
volumétricos de muestra problema. Y las ventajas que presentan al trabajar
con cantidades de pequeñas muestras, su gran sensibilidad, precisión y
exactitud.
Un espectrofotómetro es usado para medir, en función de la longitud de
onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos
a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de
química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una compleja
mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o
más componentes de esta. Pará ello, se puede utilizar el método
instrumental de análisis, como es la espectrofotometría para medir la
absorción de radiación ultravioleta y visible que interactúa con la materia
(átomos y moléculas), la misma es considerada una técnica cuantitativa
basándose en la medición del color o de la longitud de onda de una
radiación e intensidad de esta. Mediante la espectroscopía podremos
analizar las interacciones existentes entre la materia y la radiación
electromagnética. La radiación electromagnética es solo una forma de
transportar energía y ese transporte se realiza mediante un campo
magnético y uno eléctrico que se desplazan perpendicularmente, esto es
mediante una onda. Mediante una perturbación que surge en un punto la
onda transporta energía.
cm y c en g/L o mg/ml, la absorbancia A también es igual Ebc (A = Ebc),
siendo E la absortividad molar (E = a * pm) donde pm = masa molar de la
sustancia, cuando se utiliza esta expresión matemática c se expresa en
moles por litro (mol/L).
Un análisis matemático del error de medida debido a las limitaciones
instrumentales (luz no estrictamente monocromática, ruido o inestabilidad
electrónica, imprecisiones en el ajuste del equipo, etc.), lleva a concluir que
el error de medida es mínimo cuando la absorbancia es de 0.4343, que
corresponde a 36.8% de transmitancia. El error fotométrico no aumenta
mucho si se trabaja en condiciones que dan entre 15 y 70% de transmitancia
(absorbancias 0.8 a 0.15 aproximadamente). Es claro que el error
fotométrico es solo uno de los factores del error total en una determinación.
En la práctica para ajustarse a los rangos de absorbancia o transmitancia
dados, se debe trabajar dentro de un rango apropiado de
concentraciones, aunque también se podría cambiar el espesor de la
celda, o variar la absortividad específica. La absortividad específica se
puede variar, utilizando otra radiación que la sustancia absorba más o
menos, según se requiera. También se puede variar llevando la sustancia a
un estado químico que presente un mayor o menor poder absorbente; esta
última opción implica generalmente cambiar también la radiación por una
apropiada al nuevo estado de la sustancia.
Los colores y la luz blanca
Las radiaciones entre 400 y 800 nm (luz visible), las puede diferenciar el ojo
humano: 420 luz violeta, 470 azul, 520 verde, 580 amarillo, 700 rojo, y aún
tonos intermedios. La luz blanca es una mezcla balanceada de las
radiaciones entre 400 y 800 nm. Si a la luz blanca le quitamos la radiación
azul, la mezcla de las demás radiaciones da una sensación visual similar al
amarillo real; o sea que si una sustancia es de color amarillo puede ser que
absorbe todas las radiaciones menos el amarillo (580 nm) o que absorbe
preferencialmente el azul y lo que vemos es la mezcla de los demás
(decimos que el azul absorbido es el color complementario del amarillo),
Similarmente el amarillo es el complementario del azul, el rojo es el
complementario del verde azuloso.
Blanco fotométrico
Cuando se va a determinar el poder absorbente de una sustancia, esta se
encuentra generalmente dentro de un medio formado por el solvente, los
reactivos agregados u otras sustancias que la acompañan, todo lo cual
puede llegar a interferir un poco la medida. Para corregir esos fenómenos es
necesario disponer de una base de comparación, que es una solución que
contiene las sustancias que pueden causar interferencia, todos los reactivos
adicionados, pero no contiene la especie absorbente que se va a estudiar.
A esta solución se le domina “blanco fotométrico”.
Espectrofotómetro
Es un equipo diseñado para medir el % de T, la A o directamente la
concentración c, también puede trazar directamente la curva espectral y
la de calibración.
Puede clasificarse en análogos y digitales, manuales, semiautomáticos
automáticos e inteligentes; pueden cubrir varias regiones del espectro
electromagnético, según su diseño pueden ser de haz sencillo, doble haz o
haz dividido. Los equipos de doble haz dividen el haz de radiaciones en dos;
un haz pasa por el blanco fotométrico y el otro por la muestra, de modo que
hacen los ajustes automáticamente, dan mayor precisión y son útiles para
trazar espectros, o sea gráficas de transmitancia o de absorbancia contra
longitudes de onda de la radiación, lo cual facilita los análisis.
Hay espectrofotómetros para cada región del espectro (visible, ultravioleta
o infrarroja). Constan de las mismas partes esenciales apropiadas para la
región correspondiente. Las partes de un espectrofotómetro son:
a. La fuente de radiaciones: El material emisor varía, por ejemplo: gas
hidrógeno o deuterio para el ultravioleta, filamento de tungsteno, o
tungsteno halógeno para el visible, aleación de níquel y cromo, o cuerpos
incandescentes de Nernst o un Globar para el infrarrojo; existen fuentes de
muchos otros materiales para las distintas regiones. Una buena fuente debe
emitir todas las radiaciones de su región con intensidad suficiente y uniforme.
En la realidad las fuentes emiten unas radiaciones con mayor intensidad que
otras.
b. Sistema selector de una radiación de longitud de onda específica: puede
ser un filtro de absorción, de interferencia, de difracción, o un sistema
monocromador. Los filtros absorben o interfieren casi todas las radiaciones
del haz y dejan pasar selectivamente ciertos rangos estrechos de longitud
de onda; se requiere un filtro diferente para cada longitud de onda que se
termocupla o un bolómetro para el infrarrojo, diodos de silicio o un arreglo
de diodos para el ultravioleta/visible/IR cercano; estos detectores deben de
ser de un material sensible apropiado.
El sistema de lectura puede ser una aguja que se desplaza sobre una escala,
un sistema digital electrónico, o una pluma de escribir que traza un registro
sobre un papel, un monitor una pantalla de cristal líquido, una impresora.
Fundamentos teóricos de estadística para las curvas de calibración
Precisión
La precisión describe la reproducibilidad de los resultados; es decir, la
concordancia entre los valores numéricos de dos o más medidas replicadas
o medidas que se han realizado exactamente de la misma forma. En
general, la precisión de un método analítico se obtiene fácilmente
mediante la simple repetición de la medida.
La precisión indica la medida del error aleatorio, o indeterminado, de un
análisis. Los parámetros de calidad de la precisión de la desviación estándar
absoluta, la desviación estándar relativa, el coeficiente de variación y la
varianza. Estos términos se definen en la siguiente tabla:
Sesgo
El sesgo mide el error sistemático, o determinado, de un método analítico. El
sesgo se define mediante la ecuación
Donde μ es la medida de la concentración de un analito en una muestra
cuya concentración es t x para determinar la exactitud hay qué analizar
uno o varios materiales de referencia cuya concentración de analito es
conocida. Sin embargo, los resultados de dichos análisis también tendrán
tanto errores sistemáticos, pero si se realiza un número suficiente de
determinaciones, se puede detectar el valor de la media, para un nivel de
confianza dado.
Prueba del sesgo
El sesgo de un método analítico, generalmente, se detecta analizando uno
o varios materiales de referencia cuya composición se conoce. Con toda
seguridad, la media experimental del análisis x diferirá del valor verdadero μ
proporcionado para el material de referencia. En este caso, debe juzgarse
si esta diferencia es consecuencia de un error aleatorio en el análisis del
material de referencia o de un sesgo en el método usado. La forma habitual
de tratar estadísticamente este problema consiste en comparar la
diferencia x-μ con la diferencia que cabría esperar para un nivel de
probabilidad dado si no existiera sesgo. Si el valor experimental x-μ es mayor
que la diferencia calculada, es probable que exista un sesgo, por el
contrario, si el valor experimental es igual o menor que la diferencia
calculada, no queda demostrada la presencia de un sesgo.
Este test de detección del sesgo utiliza el parámetro estadístico t y se utiliza
la siguiente ecuación:
Donde N es el número de medidas replicadas que se han utilizado en el test.
La presencia de un sesgo en el método viene indicada cuando el valor de
x-μ experimental es mayor que el valor de x-μ calculado a partir de la
ecuación (2). Por el contrario, si el valor calculado a partir de la ecuación
(2) es más grande, no queda demostrada la presencia de un sesgo. En la
siguiente tabla se muestran los valores de t para varios niveles de
probabilidad:
precisión en un tratamiento matemático coherente para la sensibilidad y
proponen la siguiente definición para la sensibilidad analítica, γ.
Aquí, m es de nuevo la pendiente de la curva de calibrado y S S
es la
desviación estándar de las medidas.
La sensibilidad analítica tiene la ventaja de ser relativamente insensible a los
factores de amplificación. Por ejemplo, al aumentar la ganancia de un
instrumento por un factor de cinco, el valor de m se incrementará en cinco
veces. Sin embargo, este aumento vendrá acompañado, en general, del
correspondiente aumento en S S
y por tanto la sensibilidad analítica se
mantendrá prácticamente constante. La segunda ventaja de la sensibilidad
analítica radica en su independencia de las unidades de medida S.
Límite de detección
La definición cualitativa más aceptada para el límite de detección es la
mínima concentración o la mínima masa de analito que se puede detectar
para un nivel de confianza dado. Este límite de depender de la relación
entre la magnitud de la señal analítica y el valor de las fluctuaciones
estadísticas de la señal del blanco. Por tanto, a no ser que la señal analítica
sea mayor que la del blanco, en un múltiplo k de la variación del blanco
debida a errores aleatorios, no será posible detectar con certeza esta señal.
Así al aproximarse al límite de detección, la señal analítica y su desviación
estándar se aproximan a la señal del blanco S bl
y a su desviación estándar
bl
. Por tanto la mínima señal analítica distinguible S m
se considera que es
igual a la suma de la señal media del blanco S m
más un múltiplo k de la
desviación estándar del mismo, Esto es,
Experimentalmente, m S se puede determinar realizando 20 o 30 medidas
del blanco, preferiblemente durante un amplio período de tiempo. A
continuación, los datos se tratan estadísticamente para obtener bl S y bl s
Finalmente, la pendiente de la ecuación (3) y m S se utilizan para calcular
m c que se define como límite de detección, y cuya ecuación es:
Como ha indicado Ingle1 para determinar el valor de k en la ecuación (5)
se han usado numerosas alternativas, relacionadas correcta o
incorrectamente con los estadísticos para los niveles de confianza. Kaiser
argumenta que un valor razonable para la constante es k = 3. Considera
que es incorrecto suponer una distribución estrictamente normal de los
resultados a partir de las medidas del blanco, y que cuando k = 3, el nivel de
confianza de la detección será de un 95 por 100 en la mayoría de los casos.
Asimismo considera ventajoso un mayor valor de k y por tanto un mayor nivel
de confianza. Long y Winefordner3, en un estudio sobre límites de detección,
también recomiendan la utilización de k = 3.
por lo que se tuvieron que medir con mucho detalle los volúmenes para
preparar las soluciones.
Para poder tener el volumen exacto necesario para preparar la solución
desea, se ocupo una propipeta, al sacar el volumen de la muestra madre,
se vació en un matraz de 200 ml, una vez vaciado, se procedió a aforarlo
con agua destilada.
Una vez que se hayan preparado todas las disoluciones, cada solución con
su respectiva concentración, se coloco un poco su volumen a la celda de
cuarzo, una vez la celda tuviera el suficiente volumen, se procedió a
colocarlo en el equipo de ultravioleta, teniendo mucho cuidado de no
manchar o que hubieran gotas de la solución en la cara transparente de la
celda, ya que afectaría al momento de que el equipo lo analice, de igual
manera con precaución se coloco la celda en el lugar correspondiente
dentro del equipo, ya que la cara transparente de la celda debía estar
colocada en una cierta posición para que al momento de que la luz
atraviese la muestra, lo haga correctamente.
Al haber colocado la solución a analizar dentro del equipo, desde la
computadora se inicio el proceso, donde después de unos segundos, dentro
del programa que ocupa el equipo, nos mostro la curva correspondiente a
esta solución con cierta concentración, de esta misma manera, se prosiguió
a colocar las demás soluciones con sus distintas concentraciones y obtener
sus correspondientes curvas.
Cuando se hayan obtenido las curvas correspondientes, fue necesario
guardarlas como documentos .cvs, para que de esta forma se facilite la
obtención de los datos.
Al final de haber colocado todas las soluciones, se procedió a colocar la
solución problema, la cual basándonos con las curvas obtenidas de las
soluciones con concentración conocida, se debe calcular su concentración
de la muestra problema, de igual manera se vació un poco de esta muestra
en la celda de cuarzo y se coloco con cuidado dentro del ultravioleta, para
obtener su curva correspondiente y poder compararla con las demás de las
soluciones conocidas.
Curva de Calibración
-0.
0
1
2
3
190 240 290 340 390 440 490
Absorbancia
Longitud de onda (nm)
50 ppm
40 ppm
30 ppm
20 ppm
10 ppm
5 ppm
Muestra Problema
y = 15.854x + 0.
R² = 0.
0
10
20
30
40
50
60
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.
Concentración (ppm)
Absorbancia medidos en 243 nm
ppm Absorbancia
50 3.
40 2.
30 1.
20 1.
10 0.
5 0.
Muestra problema 1.
