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Unidad temática I: sesión V
Biofísica de la membrana celular (I):
Propiedades pasivas y activas de las
células excitables
Propósito general
Analizar las propiedades pasivas y activas de la membrana celular Comprender los procesos electrofisiológicos involucrados en cada fase del potencial de acción.
Propósito específico
Comprender el concepto de excitabilidad celular. Comprender los cambios subumbrales en el potencial de la membrana en términos de un circuito Resistencia-Capacitor (RC). Comprender los determinantes de las constantes de longitud y de tiempo Comprender el concepto de umbral. Describir las fases que constituyen al potencial de acción e identificarlas en una gráfica de voltaje vs tiempo. Analizar los cambios en la permeabilidad que subyacen a cada fase del potencial de acción. Estudiar el papel de los canales iónicos en el potencial de acción. Entender los mecanismos involucrados en los periodos refractarios absoluto y relativo.
1. Introducción
Los potenciales de acción son cambios estereotípicos, abruptos y transitorios en el potencial de membrana que ocurren en varios tipos de células animales excitables (por ejemplo, neuronas, células musculares y células endocrinas), Las células que producen potenciales de acción son consideradas células excitables y pueden ser estimuladas de manera artificial, inyectando una corriente eléctrica; de ahí su denominación de células excitables (Fig. 1).
Fig. 1. Se observa que al inyectar un pulso de corriente de 0.06 nA, se produce un potencial de acción, y conforme se aumenta la intensidad de los pulsos de corriente inyectados, se aumenta el número de potenciales de acción que la neurona genera. En las neuronas, los potenciales de acción desempeñan un papel central en la comunicación de celular siendo la base de la propagación de señales a lo largo del axón hacia las terminales axónicas, donde el cambio de voltaje produce la apertura de canales de calcio y la liberación de neurotransmisores y neuromoduladores en la hendidura sináptica. Los neurotransmisores liberados pueden a su vez actuar abriendo canales en las células postsinápticas excitables (otras neuronas, células musculares o células glandulares). En otros tipos de células no neuronales, la función principal de los potenciales de acción es activar procesos intracelulares: en las células musculares, por ejemplo, un potencial de acción es el primer paso en la cadena de eventos que conduce a la contracción; en las células beta del páncreas, provocan la liberación de insulina. Conocer las bases fisiológicas de la excitabilidad de las membranas ha permitido comprender numerosos fenómenos fisiológicos y patológicos. Numerosos y brillantes científicos aportaron ideas novedosas que fueron consolidando la disciplina que hoy en día conocemos como electrofisiología. En la página http://www.facmed.unam.mx/historia/ se puede consultar un interesante recorrido por las ideas y descubrimientos que llevaron a nuestro entendimiento actual de la fisiología de las células excitables. En la práctica anterior (Potencial de membrana), analizamos cómo el potencial eléctrico que se genera a través de la membrana depende básicamente de las concentraciones iónicas en el medio intracelular y extracelular, y de la permeabilidad relativa de cada uno de esos iones. En dicha práctica cambiamos los diferentes parámetros de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz y determinamos el voltaje que se alcanzaba en un estado estable. En esta práctica (potencial de acción), analizaremos el comportamiento de las membranas excitables cuando se les inyecta una corriente, capaz o no de producir un potencial de acción. Es común encontrar analogías donde se comparan las neuritas (axones o dendritas) de las neuronas a cables por donde fluye una corriente. Sin embargo, un análisis más detallado demuestra que, si bien las cargas eléctricas (iones) pueden fluir deforma pasiva por dentro de las neuritas, estos “cables naturales” son muy ineficientes para conducir las corrientes a distancias largas. Para poder hacer frente a este problema y poder transmitir las señales eléctricas a distancias grandes (podemos encontrar axones de más de un metro), la célula recurre a transmitir las señales eléctricas de forma activa mediante la generación de potenciales de acción.
La constante de longitud nos dice que distancia tendremos que alejarnos del sitio de máximo cambio de voltaje para encontrar que la señal decae hasta el 37% de su valor. Nótese que la constante de longitud o de espacio, depende básicamente de la resistencia de la membrana neuronal y de la resistencia interna de la neurona. Las dos formas en que las neuronas aumentan su constante de longitud es 1) aumentando la 1 resistencia membranal al poner mielina alrededor de los axones, o 2) en animales que no tienen mielina, los axones tienen un diámetro muy grande con una baja resistencia interna. Entender los conceptos de constantes de longitud y tiempo nos permite explicar muchos fenómenos que observamos en las células excitables, por ejemplo, en el principio de reclutamiento por tamaño primero se reclutan motoneuronas pequeñas y luego motoneuronas grandes, esto podría explicarse en términos de que las motoneuronas pequeñas tienen una menor capacitancia (menos membrana) y por lo tanto se cargan más rápido. También podemos entender que una neurona que tenga una constante de tiempo o de longitud mayor, tendrá mayor capacidad de sumar los potenciales postsinápticos que recibe en la misma sinapsis, pero en tiempos diferentes (suma temporal) o en diferentes sinapsis (suma espacial). Más aún podemos deducir cómo la mielina ayuda a tener una mejor conducción de las señales eléctricas, y qué ocurre cuando hay enfermedades que disminuyen la mielina y por tanto disminuyen la constante de longitud. Las constantes de longitud y de tiempo son propiedades que explican fenómenos de "conducción eléctrica pasiva", en las que la señal decae con el tiempo y la distancia. Por lo tanto, ¿cómo podemos transmitir señales tan pequeñas (cambios en el voltaje del orden de una décima de voltio) a distancias largas? La respuesta está en que las neuronas usan canales iónicos que se “activan” rápidamente por cambios en el voltaje y son fundamentales para generar potenciales de acción. Podemos pensar en los potenciales de acción como una solución al decaimiento producido por las constantes de longitud y de tiempo. Conforme un potencial de acción se propaga por el axón, se van abriendo y cerrando canales de sodio y potasio, lo que permite regenerar el potencial de acción en cada parte de la membrana. Por último, es importante conocer cómo participan los canales iónicos en cada fase del potencial de acción para entender cómo es que los cambios en sus conductancias producen los cambios rápidos, transitorios y estereotípicos en el potencial de membrana que caracterizan a un potencial de acción. Este conocimiento permite entender diferentes fenómenos fisiológicos y patológicos, por ejemplo, de qué manera las alteraciones en los electrolitos pueden modificar la forma de los potenciales de acción o abolirlos completamente, tal como lo hacen algunas toxinas o fármacos como los anestésicos.
2. Metodología
Se utilizará en esta práctica el programa Metaneuron®, (un simulador gratuito creado por Eric A. Newman y Mark H. Newman de la universidad de Minnesota). Este programa modela las propiedades básicas de neuronas y axones^1. El programa está organizado en 6 lecciones, de las cuales se sugiere que el docente use las cuatro primeras (Potencial de membrana en reposo, Constante de tiempo de la membrana, Constante de longitud de la membrana y Potencial de acción) para realizar experimentos virtuales que permitan analizar las propiedades pasivas y activas de las
neuronas y sus determinantes. Se puede bajar el programa para PC y Mac y el instructivo de uso en la siguiente dirección: http://www.metaneuron.org A juicio del profesor se sugiere que se revise en grupo la lección 1 (los conceptos se repiten con la práctica anterior por lo que no debe tomar mucho tiempo y permite sentar las bases para el uso del programa y la dinámica de trabajo). Las lecciones 2 - 4: abordan 3 temas importantes: Propiedades pasivas de las neuronas Lección 2 (constante de tiempo) Lección 3 (constante de longitud) Propiedades activas de la membrana Lección 4 (potencial de acción) Se sugiere conformar grupos de alumnos que desarrollen por separado las lecciones 2 a 4 y después expliquen y discutan sus resultados. Esta estrategia permite que los alumnos construyan su propio^2 conocimiento, con la guía del profesor. Además, que fomenta un pensamiento crítico y habilidades de comunicación. (^2) Con excepción de la lección 3, en la que se considera una dendrita de longitud infinita, el resto de las lecciones representan 1 cm^2 de membrana que tiene una capacitancia de 1μF. (^3) Los laboratorios solo cuentan con 2 computadoras y dada la recomendación de trabajar en grupos, se recomienda que alguno de los alumnos o el profesor lleve su propia computadora. El programa para PC y MAC estará en el escritorio de las computadoras para que sea copiado. (también lo pueden descargar libremente directamente de la página arriba mencionada). I nstrucciones Generales de uso del programa Metaneuron®:
- Abrir el programa Metaneuron®
- Al dar click en el menú que dice “Lesson”, seleccionar una opción del 1 al 4
- Cambiar los parámetros de acuerdo a la lección. Por ejemplo, al abrir la lección 1, me permite cambiar las concentraciones internas y externas de Sodio y potasio, así como las permeabilidades relativas. Hay tres formas de cambiarlas: a. Escribir el valor directamente en la casilla. b. Dar click derecho en la casilla gris y mantener apretado el ratón mientras lo mueves a la derecha o izquierda (esto permite que los valores suban o bajen de forma continua). c. Dar click en la casilla blanca y especificar un rango de valores (se activarán las casillas de abajo, donde se debe especificar cuál es el valor inicial, el valor final y cuánto vale cada incremento).
Lección 1: Potencial de membrana en reposo (este primer experimento opcional, sirve para repasar los conceptos vistos en el simulador anterior y también es útil para familiarizarse con el uso del programa, el profesor puede decidir empezar directamente con las lecciones 2- 4 ) En esta lección las conductancias pasivas a K+^ y Na+^ son independientes del voltaje y la neurona no genera potenciales de acción. Las conductancias a ambos iones pueden variarse en el simulador en la lección. Y el simulador calcula los potenciales en equilibrio de cada ion y el potencial de membrana en reposo con las ecuaciones de Nernst y GHK· El objetivo es comprender los factores que determinan el potencial de membrana en reposo (determinado por las concentraciones de K+^ y Na+^ fuera y dentro de la célula y por la permeabilidad de la membrana a K+^ y Na+). Para esto en el software las permeabilidades relativas de la membrana a K+^ y Na+, así como las concentraciones de estos iones pueden variarse y el potencial de membrana se calcula utilizando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Ejercicios primera parte (no es necesario el simulador)
- Utiliza las concentraciones de potasio que vienen por defecto en el programa (3mM extracelular y 63.7 mM intracelular) y calcula el potencial en equilibrio del potasio con dichas concentraciones usando la ecuación de Nernst.
- Calcula ahora cuál es el potencial de equilibrio del potasio si inviertes las concentraciones (3mM intracelular y 63.7 mM extracelular)
- Ahora determina los potenciales de equilibrio del potasio para cada una de las siguientes concentraciones extracelulares de potasio, mantén la concentración intracelular en 63.7 mM: a) 1 mM b) 3 mM c) 5 mM d) 30 mM e) 60 mM f) 126 mM Construye una gráfica con los datos obtenidos en el ejercicio poniendo en el eje de las abscisas la concentración extracelular de potasio y en el eje de las ordenadas el valor obtenido. Traza una curva que una los puntos. Ejercicios segunda parte (usando el simulador)
- Ahora probaremos la hipótesis de que el potencial de membrana de una célula está determinado por las concentraciones de potasio (E m = Ek ). En el simulador con los mismos valores de potasio extracelular que usaste determina el potencial de membrana que se obtiene. Grafica dichos valores.
- Haz lo mismo que en el punto anterior, pero cambiando la permeabilidad del sodio a valores de 0 y 2. Explica: ● ¿Qué ocurre con el potencial de equilibrio de potasio cuando inviertes las concentraciones intra y extracelulares? ● ¿Por qué la magnitud del cambio en el potencial de equilibrio es diferente si disminuyes 2 mM que si aumentas dos mM? ● ¿Qué concentraciones debe haber para que el potencial de equilibrio del potasio sea cero? ● ¿Cómo explicas los resultados de probar tu hipótesis? Lección 2: Constante de tiempo de la membrana Para explorar la constante de tiempo de la membrana utilizaremos la lección 2. Esta lección permitirá entender con más claridad la relación entre membrana - capacitancia y canales - resistencias. Permitirá saber por qué el tamaño de una célula es importante en determinar cuál será el cambio en el potencial que se alcanza cuando recibe un estímulo. Y por último permitirá entender la relación entre la constante de tiempo y la suma temporal de potenciales postsinápticos. En esta simulación la capacitancia de la membrana es igual a 1 μF/cm 2, o simplemente 1μF ya que se considera que en la simulación la membrana tiene una superficie de 1cm 2, en el simulador se puede variar el valor de la resistencia de la membrana, así como la duración y la amplitud del pulso de corriente. Es importante mencionar que con fines de poder ver con más claridad las propiedades pasivas de la membrana, la “neurona” de esta lección no genera potenciales de acción (simulando que se han bloqueado los canales de Na+ dependientes de voltaje). Recuérdese que en un circuito constituido por una resistencia en serie con una capacitancia (ver el modelo eléctrico de la membrana), la constante de tiempo RC de una neurona (también llamada tau), es igual al producto de la resistencia (ohms) y la capacitancia (Farads). tau = Rm * Cm Y se puede definir como el tiempo que se requiere para que el capacitor (la membrana), se cargue a través de la resistencia (los canales) desde un voltaje inicial de 0, hasta un 63% del valor final que se alcanzará con la corriente que se aplique. En el simulador de esta lección, el valor que trae por defecto para el estímulo eléctrico (un pulso de 1 ms en la línea roja), simula un potencial postsináptico excitador. La línea morada es el “umbral de la neurona”, donde se producirían potenciales de acción normalmente (recuérdese que para esta lección se ha evitado que se generen potenciales de acción). La línea amarilla es el potencial de membrana. También se pueden cambiar el número de estímulos “number of stimuli” y el tiempo entre ellos “period”. Por último, se puede cambiar la duración del registro en caso de querer aplicar un estímulo de una duración mayor para poder observar el momento en que se alcanza la meseta del cambio en el potencial inducido por un estímulo eléctrico.
misma membrana con 2 ms entre cada uno. Puedes observar que las respuestas se suman (suma temporal). J. Reduce la resistencia de 10 ㏀ / cm 2 a 2 ㏀ / cm 2. K. Disminuye o aumenta el tiempo entre los estímulos y evalúa qué pasa con la suma temporal. Explica el efecto de reducir la resistencia, sobre la suma temporal, y cuál es la importancia en determinar si una neurona generará o no potenciales de acción ante un estímulo. (recuerda que el umbral de la línea morada) ¿Qué condiciones favorecen que pueda haber suma temporal de los estímulos? Lección 3: Constante de longitud de la membrana El objetivo de esta lección es entender el efecto que tiene la constante de longitud en la transmisión pasiva de cambios en el voltaje a lo largo de una neurita (dendrita o axón). El simulador modela la neurita como un cilindro de diámetro uniforme. Los valores que se pueden variar son la resistencia de la membrana (Rm), la resistencia interna citoplasmática (Ri), y el diámetro (d) de la neurita. Los estímulos se aplican en X = 0 μm. Cuando se despolariza una dendrita en un punto X, el potencial decae con la distancia, conforme se conduce pasivamente el potencial. En los parámetros que vienen por defecto en esta lección el estímulo “stimulus” aplicado tiene una intensidad de 2 pA y una duración de 50 ms. La gráfica de potencial vs distancia, muestra el potencial de membrana que se registra en sitios adyacentes al sitio de estimulación (0 μm).
- Calcula la distancia que toma al voltaje disminuir a un 37% de su valor máximo, compáralo con el valor que obtienes al resolver la fórmula para determinar la constante de longitud: ƛ = 0.5 √ d * Rm / Ri Donde: = constante ƛ de longitud (cm) d = diámetro de la dendrita (cm) Rm = resistencia de la membrana (k Ω * cm2) Ri = Resistencia interna de la dendrita ( Ω* cm2) ● Ahora incrementa la amplitud del estímulo a 10 pA y cambia la longitud “length” del registro a 1000 μm en el recuadro de “Potential vs. Distance”. Grafica el valor de la constante de tiempo en función de las siguientes resistencias de membrana: 1, 2, 5, 10, 15 y 20 (k Ω * cm2) ¿Cuál es la relación entre las dos variables? ● Ahora regresa la resistencia de membrana a su valor de 1 k Ω * cm2. Grafica el valor de la constante de tiempo en función de cambiar las siguientes resistencias internas: 10, 50, 70, 100 y 200 (k Ω * cm). ¿Cuál es la relación entre las dos variables?
● Regresa la resistencia interna a su valor de 70 k Ω * cm. Grafica el valor de la constante de tiempo en función de cambiar el diámetro de la neurita: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 μm. ¿Cuál es la relación entre las dos variables? ¿Qué efecto tendrá variar el diámetro de un axón? ¿Cómo puedes aumentar la resistencia de la membrana de un axón? Lección 4: Potencial de acción Esta lección del simulador se basa en las ecuaciones descritas por Hodgkin y Huxley en 1952 para describir los cambios dependientes de voltaje de las conductancias de Na y de K en el axón gigante de calamar.^5 En el simulador se pueden cambiar varios parámetros de la preparación: a) los potenciales de equilibrio de Na, K y de la corriente de fuga; b) las conductancias (representando el número de canales abiertos) de Na, K y fuga; c) la temperatura (elevar la temperatura cambia las constantes de tiempo de activación de los canales de Na y K) d) la aplicación de TTX (bloqueador de canales de Na) y TEA (bloqueador de canales de potasio dependientes de voltaje) También se pueden ajustar los parámetros del estímulo. (^5) Las conductancias de Na representan canales sensibles a TTX y las conductancias de K representan canales rectificadores entrantes sensibles a TEA, también se incluye una corriente de fuga. Los valores se han ajustado para simular un potencial de acción en un axón de vertebrado. Se pueden generar hasta dos pulsos de corriente de los que se puede controlar la intensidad, duración y momento en que se aplica (delay). Estos pulsos de corriente pueden sobreponerse a un estímulo constante de inyección de corriente (holding current). También, adicionalmente a los cambios en potencial de membrana generados por los pulsos de corriente, en el panel “conductances and currents” se pueden mostrar los cambios en las conductancias iónicas y en las corrientes iónicas. Ejercicios: Encontrar el Umbral: cambia gradualmente (pasos de 0.1 A) en la amplitud del “estímulo 1”. Describe los efectos que tiene este cambio en la respuesta de la célula. Encuentra cuál es la amplitud en amperes del estímulo necesario para iniciar un potencial de acción. Efecto de cambiar el potencial de equilibrio del Sodio y Potasio: Con los valores por defecto, cambia el potencial de equilibrio del sodio y del potasio. ¿Cómo se afecta el potencial de acción? ¿Qué implicaciones tiene esto para casos de alteraciones hidroelectrolíticas?
