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Una investigación congruente sobre el tema
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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27 /11/
“Péptidos Antimicrobianos producidos por células humanas que nos ayudan a combatir las superbacterias, utilizadas en bioterrorismo”
La situació n actual de resistencia de los microorganismos a los antibió ticos convencionales ha llevado a la bú squeda de alternativas antimicrobianas. Para poder hacer frente a las superbacterias es esencial evitar el uso indebido de los antibióticos Las superbacterias son un fenómeno que aparece de forma natural con el tiempo, por modificaciones genéticas. Pero el proceso se acelera por el mal uso y abuso de los antibióticos. Los pacientes afectados por una superbacteria tienen un mayor riesgo de padecer complicaciones y secuelas graves de la infección, así como un mayor riesgo vital Para poder hacer frente a las superbacterias es esencial evitar el uso indebido de los antibióticos. Los pé ptidos antimicrobianos resultan una buena alternativa debido a su relativa inespecificidad en cuanto a su mecanismo de acció n, debido a que a los microorganismos no les resulta sencillo desarrollar cepas resistentes, ya que para ello serí a necesario cambios en la composició n lipí dica de sus membranas. Una vez identificada la secuencia codificante de estos pé ptidos, se llevan a cabo té cnicas de biologí a sinté tica y de ADN recombinante para modificarlos e introducirlos en el genoma de la Staphylococcus aureus. É sta resulta ser un excelente modelo de expresió n debido a su pequeñ o genoma, que facilita el que pueda ser manipulada gené ticamente, a su bajo coste de producció n, su f ácil cultivo y que generalmente son consideradas inocuas para el ser humano.
Hoy en la actualidad existen problemas y enfermedades a causa de las bacterias que han ido evolucionando a causa de su resistencia a los antibióticos y se han convertido en las llamadas “superbacterias” las cuáles son un gran problema a nivel global ya que afecta a cualquier sistema biológico. Por lo tanto para esta propuesta de anteproyecto elegimos una idea la cuál consiste en realizar un método que nos ayude a contrarrestar la resistencia de las superbacterias con péptidos antimicrobianos mediante la tecnología de ADN recombinante. Antecedentes “Mecanismos de Replicación de los Plásmidos Bacterianos” Pedro D. Loeza Lara, Juan J. Valdez Alarcón, Victor M. Baizibal Aguirre y Joel L E. López Meza. Resumen: Los plásmidos bacterianos son moléculas de ADN extracromosómico que juegan un papel importante en la adaptación bacteriana a diferentes ambientes, ya que promueven la
Resumen: Desde el punto de vista bioquímico, existen diferentes macromoléculas, en ellas se destacan las proteínas, los carbohidratos y los lípidos, cada una con diferente función biológica; en este grupo también es posible encontrar los péptidos, que son secuencias de aminoácidos relativamente cortas en relación con las proteínas, por lo que se clasifican en otro grupo bioquímico y poseen características importantes como su acción antimicrobiana. Estudios han demostrado que los péptidos ejercen una defensa ante patógenos; entre estos Péptidos Antimicrobianos - PAM, se encuentran las defensinas, las catelicidinas y las lactoferrinas, estas estructuras pueden constituirse en una alternativa ante resistencia bacteriana frente a los antibióticos convencionales que han crecido en los últimos años. “Péptidos antimicrobianos” Germán Alberto Téllez1, Jhon Carlos Castaño. Resumen: Los péptidos antimicrobianos son las moléculas efectoras del sistema inmune innato, cuyas familias se encuentran en casi todos los organismos, desde bacterias hasta mamíferos. Son una familia de sustancias polifacéticas con complejos mecanismos de acción relacionados con la interacción con el patógeno a través de su membrana, o afectando blancos internos, como la replicación del ADN y la síntesis de proteínas, e interactuando con el huésped con funciones inmunomoduladoras de la regulación del proceso inflamatorio y de la cicatrización. Aunque la generación de resistencia a los péptidos antimicrobianos es mucho menor si se compara con la generada por los antibióticos convencionales, existen mecanismos de resistencia ya descritos, como la degradación por proteasas, la liberación de proteínas inhibidoras o los cambios en la conformación de la membrana externa del patógeno. El estudio de estas sustancias ha permitido evidenciar sus usos potenciales en el ámbito clínico para contrarrestar los inconvenientes de la resistencia a los antibióticos; sin embargo, a pesar de los grandes avances logrados en este campo, aún quedan puntos controversiales por dilucidar. “Péptidos antimicrobianos, una alternativa prometedora para el tratamiento de enfermedades infecciosas” Kevin Samael Olascoaga Del Angel, Grecia Sánchez-Evangelista, Israel Carmona- Navarrete, María del Carmen Galicia-Sánchez, Angélica Gómez-Luna, Susan Janneth Islas Arrollo y Jorge Ismael Castañeda-Sánchez Resumen: Los microorganismos causantes de enfermedades en humanos evolucionan constantemente, lo que representa un reto en la bú squeda de tratamientos efectivos contra estos pató genos. Aún cuando en la actualidad se cuenta con diversas alternativas farmacoló gicas, estas en ocasiones resultan ineficientes para el control de las enfermedades infecciosas, sobre todo porque los pat ó genos han generado mú ltiples mecanismos de resistencia. Los pé ptidos antimicrobianos se han descrito en muchas especies de organismos: hongos, plantas, insectos y humanos; en la actualidad se presentan como una solució n terapé utica que puede ser efectiva. La ventaja de estos pé ptidos naturales es que llevan evolucionando casi la misma cantidad de tiem- po que las especies que producen y su efecto en el control de los microorganismos es muy notable; algunas de estas mol é- culas son
aisladas de organismos vivos y otras se comienzan a producir por m étodos sinté ticos, lo que permite tener acceso a un sinfí n de posibles pé ptidos con actividades terapé uticas diversas. Justificación: Este proyecto se realizó con la intención de dar a conocer un poco más sobre las super bacterias ya que ha sido un problema que ha estado surgiendo en estos últimos años, un desarrollo de superbacterias que están siendo muy peligrosas para los seres humanos, animales, plantas, etc. Ya que cada dia se hacen más fuertes a la resistencia de medicamentos o soluciones para contrarrestarlos, de alguna manera se experimenta de mala manera ya que con ellas se practica el bioterrorismo en una variedad de países lo que conlleva esto a obtener algún modelo defensivo ante estas misma situación como lo que logramos en este proyecto, lo que es encontrar un modelo defensivo ante estas superbacterias por ello mismo se brinda más información sobre las características de las superbacterias y el impacto que tienen en nuestro planeta, con los humanos y cualquier sistema biólogico. Marco Teórico Péptidos antimicrobianos (PAM): son moléculas relativamente pequeñas que contienen entre 12 y 60 aminoácidos, forman parte de la respuesta de defensa de diversas especies de organismos y participant mediando la respuesta primaria hacía varios patógenos como bacterias, parásitos, infecciones víricas y fúngicas. Plásmido: es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra en las bacterias y algunos otros organismos microscópicos. Los plásmidos están separados físicamente del ADN cromosómico y se replican de manera independiente. Habitualmente tienen un número reducido de genes (cabe señalar, algunos asociados a la resistencia a los antibióticos), y se pueden transmitir de una célula a otra. Los científicos utilizan métodos de ADN recombinante para insertar en un plásmido genes que desean estudiar. Cuando el plásmido se copia a sí mismo, también hace copias del gen insertado.
desaparezcan. Los exones son los que permanecen en el ARNm maduro y, finalmente, son el código de los aminoácidos. Muchas veces, incluso estudiantes de medicina como mi esposa, olvidan si se trata de los exones o los intrones los que codifican los aminoácidos. Vamos a dejar claro que son los exones, porque a veces la gente recuerda que los exones son eliminados, pero eso no es verdad. Es que los intrones interfieren. Así que siempre tiene que recordar que los intrones interfieren, y son extirpados del ARN para dejar unidos una serie de exones que codificarán los aminoácidos. Catelicidinas: son un grupo estructuralmente heterogéneo de moléculas antimicrobianas presentes en algunas especies de mamíferos que están codificadas en genes formados por tres intrones y cuatro exones. No obstante, únicamente es funcional el dominio de antimicrobiano codificado en el último exón, puesto que son sintetizadas como pre-pro-péptidos (Figura 3), cuyo procesamiento consiste en la eliminación proteolítica del propéptido tras la degranulación de neutrófilos. Todas las catelicidinas incluyen en sus extremos N-terminal péptidos señal seguidos de un dominio similar a catelina (la pro-región), muy conservado entre especies, seguido por un dominio antimicrobiano en su extremo C-terminal, muy diverso, y que carece de secuencias conservadas o consenso. El dominio C-terminal es el que representa el péptido activo biológico. Los genes que codifican las catelicidinas de vertebrados tienen alrededor de 2 kb de tamaño y todos contienen cuatro exones. Hasta la fecha, los genes de catelicidinas sólo se han observado en los vertebrados. En humanos y en los vertebrados superiores, el exón 4 siempre codifica para el péptido de catelicidina activo. Las regiones promotoras de los genes de catelicidina contienen sitios de reconocimiento que también se encuentran en las regiones promotoras de los genes que participan en la respuesta inmune. La mayoría de las
catelicidinas se almacenan en forma de pro-péptido inactivo, dentro de los gránulos de las células inmunes circulantes. Sin embargo, también se expresan en diversas células no mieloides, particularmente en sitios tales como la superficie de la piel y de las mucosas externas. ADN recombinante (rADN) : Es una tecnología que utiliza enzimas para cortar y unir secuencias de ADN de interés. Las secuencias de ADN recombinado se pueden colocar en unos vehículos llamados vectores que transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula huésped donde puede ser copiado o expresado. Hipótesis Lograr modificar genéticamente a las Superbacterias, mediante la ayuda de los péptidos antimicrobianos. Objetivo El objetivo de este proyecto es encontrar un gen que codifique a un péptido antimicrobiano, que pueda ser expresado en un plásmido que nos ayude a introducirlo al genoma de la bacteria “ Staphylococcus aureus” , la cual se encuentra en la microbiota del ser humano y son fuertemente resistentes ante los antibióticos y esto conlleva una cantidad inmensa de problemas de salud debido a que no podemos combatir a estas superbacterias. De este modo, modificaremos genéticamente a esta bacteria para que se contrarreste este fenómeno en ellas. Marco Metodológico Insertaremos un gen que codifique a un péptido con actividad antimicrobiana, el cuál utilizaremos el “ LL37 de la familia de las Catelicidinas ” en un plásmido que sea compatible con el genoma humano que tendrá acción transportadora para ser insertado en el genoma en una célula bacteriana para expresar el gen humano el cual se encarga de la producción y expresión del péptido antimicrobiano. Una vez expresado el gen en la bacteria, que para este caso utilizaremos bacterias de la familia Firmicutes y Bacteroidetes los cuáles se clasifican en : Bacillales, Lactobacillales, Clostridia, Mollicutes. Nos enfocaremos en los bacillales; Staphylococcus aureus. Para esta propuesta emplearemos la tecnología de ADN recombinante : Esta tecnología nos permitirá obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen de nuestro interés. Este ADN se podrá incorporar a las células de un organismo, en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. De una manera muy simple podemos decir
Para la preparaci ó n del gel se emplean 3 gramos de agarosa, se enrasan con tamp ó n TAE hasta alcanzar los 200 ml y se lleva a ebullició n para disolver bien la agarosa. Se coloca el peine para formar los pocillos de carga, se añ ade la agarosa disuelta en el TAE y se deja solidificar, aproximadamente unos 10-15 minutos. Posteriormente, se retira el peine y se procede a cargar 10 μl de la muestra. En proceso se preparará una mezcla de fragmentos de ADN y se pondrán en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazarán en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se moverán rápidamente, mientras que los grandes lo harán muy lentamente.
Diagrama ilustrativo:
2. Transformamos y seleccionamos nuestra bacteriana: Staphylococcus aureus **3. Producción de proteínas
Pasos de la PCR:
Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial. Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados de la PCR:
Conclusiones Durante la elaboración de esta Propuesta de Anteproyecto, nos dimos cuenta de la gran problemática de las “Super bacterias” debido a su resistencia a fármacos que presentan estos microorganismos, fue necesario implementar una técnica para poder producir nuevos mecanismos de tratamiento utilizando como modelo “Péptidos antimicrobianos”, que fueran capaces de actuar directamente en el control de los patógenos o que indirectamente activen al sistema inmune del hospedador. Los péptidos antimicrobianos pueden ser una excelente opción para el tratamiento de enfermedades infecciosas, ya que existe una gran diversidad de estas moléculas y sus usos no se limitan a infecciones causadas por microorganismos comunes (bacterias, virus, hongos y parásitos). Los péptidos antimicrobianos para uso terapéutico se pueden obtener mediante síntesis químicas o aislados directamente de alguna fuente natural, por lo que su número puede ser bastante amplio. Los PAM por sí solos muestran un amplio espectro, lo que falta por explorar es la posibilidad de combinarlos en el tratamiento de infecciones, con fármacos que se encuentran disponibles comercialmente y que se usan convencionalmente, con el fin de evaluar si la terapia combinada pueda potenciar su efecto. El uso de estas moléculas cada vez es más frecuente y exitoso, y a pesar de que ciertos péptidos aún se encuentran en etapas clínicas tempranas, su uso a mediano plazo puede ser una opción prometedora, sobre todo si consideramos la resistencia a fármacos que han desarrollado muchos patógenos que generan enfermedades en los humanos. Así que nos dimos a la tarea de investigar cómo podríamos obtener este péptido que elegimos (Catelicidina), y lo obtendremos de manera comercial en: LL37 vial 6mg - Cuerpoymente.mx Qué es LL37? LL-37 es un péptido antimicrobiano. Se ha demostrado que tiene actividad antimicrobiana contra múltiples patógenos humanos gramopositivos y gramonegativos. Los péptidos antimicrobianos ( antimicrobial peptides , o AMP) tienen el potencial de servir como una alternativa a los antibióticos. Los péptidos antimicrobianos forman una parte central de la inmunidad innata de humanos y mamíferos. Funcionan al matar a los patógenos microbianos y pueden regular la invasión de bacterias y de algunos virus.
LL-37 pertenece a la familia de péptidos antimicrobianos de catelicidina. Se libera cuando se estimulan los neutrófilos (tipo de glóbulo blanco). LL-37 se expresa en diversas células y tejidos del cuerpo, como neutrófilos circulantes, células de la médula ósea, células epiteliales de la piel, células del tracto gastrointestinal, así como en el epidídimo y los pulmones. Para posteriormente mandarlo a desarrollar en el laboratorio: GeneCount® qPCR testing solutions - LuminUltra
