¡Descarga Productividad de agar-agar de Gracilaria cylindrica y Gracilaria mammillaris y más Resúmenes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
Julio-diciembre 2007
EVALUACI”N POR M…TODO ECOM…TRICO DE AGAR
OBTENIDO DE ALGAS ROJAS COLOMBIANAS
EVALUATION FOR ECOM…TRIC METHOD OF AGAR
OBTAINED OF COLOMBIAN RED ALGAE
(^1) A. Villalobos, 1 L. Calderón, 1 C. Figueroa, 1 J. Fierro, 1 G. Otálora, 2 R. Álvarez, 1 B. Quevedo-Hidalgo, 1 M. Mercado-Reyes, 1 M. Huertas-Valero, (^1) A. Trespalacios-Rangel
(^1) Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana. Carrera 7 No 43-82, Bogotá, Colombia (^2) Fundación Maguare. Manizales (Caldas) Colombia alba.trespalacios@javeriana.edu.co
Resumen
La finalidad de este estudio fue evaluar la productividad del agar-agar obtenido a nivel de laboratorio de dos especies de algas rojas del género Gracilaria provenientes de la costa Caribe de Colombia ( G. cylindrica y G. mammillaris ). La productividad del medio de cultivo elaborado con base agar - agar se determinó utilizando el método ecométrico con 20 especies bacterianas diferentes. Los valores del índice de crecimiento absoluto (ICA) e índice de crecimiento relativo (ICR) obtenidos mostraron que el agar base Gracilaria mammillaris y Gracilaria cylindrica son igualmente productivos, con lo cual se demuestra que ambas especies se pueden utilizar en la producción de agar
Palabras clave: agar, algas marinas, Gracilaria cylindrica, Gracilaria mammillaris.
Abstract
The purpose of this study was to evaluate the productivity on agar-agar of two species of red algae of the genera Gracilaria belonging from the Colombiam Caribean coast ( G. cylindrica and G. mammillaris ) obtained in laboratory. Productivity of culture media elaborated with base agar - agar was determined using the ecometric method with 20 different bacterial species. Results obtained from ICA and ICR showed that agar extracted from Gracilaria cylindrica and Gracillaria mammillaris are equally productive, this shows that both species can be used for agar production. For better results, it is still necessary to optimize extraction processes and purification of agar in both species of algae.
Key words: agar, marine algae, Gracilaria cylindrica , Gracilaria mammillaris.
UNIVERSITAS SCIENTIARUM Revista de la Facultad de Ciencias Vol. 12, ediciÛn especial III, 57-
Universitas Scientiarum, Vol 12, edición especial III, 57-
INTRODUCCIÓN
El agar es un polisacárido constituido de agarosa y agaropectina que se extrae de las paredes de las algas Rhodophyta. Se deno- minan algas rojas a los miembros del filo Rodophyta , un grupo de algas con más de 4000 especies agrupadas en 650 géneros. Las algas rojas se caracterizan por tener pigmentos ficobilínicos que les confieren el color rojizo (ficoeritrina y ficocianina), y que enmascaran el color de las clorofilas. La mayoría de las especies crecen cerca de las costas tropicales y subtropicales deba- jo de la línea intermareal (Freile-Pelegrin et al., 1995; Cognetti et al. , 2001).
La demanda de algas especialmente para la elaboración de algunos ficocoloides impor- tantes (alginatos, agar, carragenano) ha cre- cido con rapidez en los últimos diez años. Este desarrollo no muestra señales de dis- minución debido al potencial de las algas como fuente directa de proteína, productos farmacéuticos y la demanda de gomas ve- getales que será el factor que más influirá en la explotación futura de los recursos mundiales de algas marinas (McHugh, 2002).
El agar es utilizado principalmente como base para los medios de cultivo microbio- lógicos, aunque también tiene muchas apli- caciones en la industria alimenticia y farmacéutica a nivel mundial (Kirk, 1998). La idea de utilizar el agar como soporte de medio de cultivo bacteriano sólido, fue concebida por la alemana Frau Fanny Eilshemius Hesse en 1881. El descubri- miento fue dado a conocer a Robert Koch, quien empleó esta sustancia como medio de cultivo en sus famosos experimentos sobre el bacilo de la tuberculosis. En su nota preliminar acerca de dicho microor- ganismo, publicada en 1882, Koch anun- ció el agar como un nuevo medio sólido para cultivo microbiológico. Desde enton-
ces se ha convertido en el uso más común para el mismo (Freile-Pelegrin et al. , 1995).
Actualmente la totalidad del agar para uso microbiológico que se consume en Colom- bia se importa de otros países como Estados Unidos, Chile y Portugal. En cuanto a la di- versidad de algas disponible en el Caribe colombiano, tanto en la zona costera como en las zonas oceánicas se dice que actual- mente existen 565 especies de algas (16 ver- de-azuladas, 165 verdes, 70 pardas y 314 rojas) (Díaz-Pulido y Díaz-Ruiz, 2003).
El análisis ecométrico establece la eficien- cia con la cual un medio de cultivo sirve para recuperar una cepa, mediante la com- paración que se realiza entre el medio a evaluar y un medio control. Esta técnica evalúa tanto la sensibilidad de los medios a la colonización por los microorganismos buscados (productividad) como también la resistencia a la colonización por las cepas que interfieren (selectividad). Un parámetro útil para interpretar los resultados ecomé- tricos es el índice de crecimiento absoluto (ICA). Éste denota el último sector de la placa en el cual ha habido un crecimiento significativo. Otro parámetro es el índice de crecimiento relativo (ICR) que relacio- na los valores de ICA del medio a evaluar con el ICA del medio control (Mossel, 2003).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la productividad de un medio de cultivo pre- parado con agar obtenido de algas marinas Gracilaria mamillaris y Gracilaria cylin- drica. Se plantearon dos hipótesis, en la primera se propuso que no debía existir di- ferencia de proporciones de cepas con re- sultados de ICA alta y medianamente productivos entre los medios prueba y los medios control y la segunda hipótesis plan- teó que los medios prueba con resultado de ICR=1, tienen una capacidad de recupera- ción de cepas superior al 80%.
Universitas Scientiarum, Vol 12, edición especial III, 57-
realizaron curvas de crecimiento por tripli- cado en caldo BHI. Los cultivos iniciales de cada una de las especies se incubaron por 18 horas a 37°C en agar McConkey para las enterobacterias y en agar sangre para los cocos Gram positivos y para B. bronchisep- tica. El inóculo se preparó con 2 ml de la suspensión de la respectiva bacteria en so- lución salina 0,85% (p/v) llevada al tubo n° 1 de la escala de Mc Farland y 18 ml de caldo BHI (infusión cerebro corazón), y se incubó por 12 horas a 37°C a 150 rpm. Para la fermentación discontinua, se mezcló el anterior inóculo con 180 ml de BHI estéril (10% del volumen total del inóculo) y se mantuvo durante 24 horas en las mismas condiciones del inóculo (37°C a 150 rpm). Se realizaron muestreos cada dos horas para realizar las curvas de crecimiento.
El medio nutritivo para las pruebas micro- biológicas se preparó según el protocolo PNT-ME-010 y la composición final del medio fue: peptona 5 g/l, extracto de leva- dura 5 g/L y cloruro de sodio 5 g/L. Para los diferentes procedimientos del método ecométrico se utilizó agar bacteriológico de dos casas comerciales diferentes y agar bacteriológico obtenido de G. cylindrica y G. mammillaris.
Concentración de agar-agar
Con el agar-agar extraído de las algas rojas colombianas, se realizaron diferentes con- centraciones (g/l): 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4, y 5,0% (p/v), se hidrataron durante 1 hora en agua tibia, y se dejaron a fuego lento hasta alcanzar su ebullición. Posteriormente se hicieron pruebas de gelificación para de- terminar la concentración ideal o de mayor consistencia.
Pruebas microbiológicas
El agar-agar sin adición de nutrientes fue inoculado con S. epidermidis, E. coli y B. bronchiseptica con el fin de verificar si el
agar aportaba nutrientes a los microorga- nismos.
Método ecométrico
La selección del método ecométrico se rea- lizó teniendo en cuenta la comparación con otros como: Miles-Misra, y el de estrías (Michanie, 1992). Según Kornacki et al (2003), entre las ventajas del método eco- métrico se destacan la facilidad y rapidez en la ejecución de la prueba, la eficiencia para evaluar varios lotes de medios de cultivo y el uso de un inóculo estandarizado en don- de se garantiza la misma cantidad de micro- organismo en todas las siembras.
La evaluación de la productividad del me- dio de cultivo se realizó a través del análi- sis del método ecométrico (Mossel, 2003) el cual se procesó por triplicado para cada una de las especies bacterianas.
Se inoculó el medio de prueba (agar nutri- tivo con agar base G. mammillaris y G. cylindrica respectivamente) y dos contro- les comerciales (control 1 y control 2)
Por medio de este método se evaluó la efi- ciencia con la cual el medio de cultivo sirve para recuperar los diferentes microor- ganismos, mediante la comparación que se realiza entre un microorganismo referente y un microorganismo interferente. En este estudio el microorganismo interferente fue S. pneumoniae , y los referentes fueron los 20 restantes mencionados anteriormente.
Un parámetro útil para interpretar los resul- tados es el índice de crecimiento absoluto (ICA), el cual se calculó para determinar la productividad de los medios. La interpre- tación de este índice se fundamenta en la siguiente clasificación: ICA menor a 2, (bajamente productivo), ICA entre 2,5-4, (medianamente productivo) e ICA mayor a 4,0 (altamente productivo). Medios con
Julio-diciembre 2007
ICA menor a 2,5 no deben utilizarse, ni sa- lir al mercado.
Los valores de ICA obtenidos se expresa- ron como índice de crecimiento relativo (ICR), para comparar el medio prueba con un medio de referencia, en este caso con los dos controles comerciales. Éste se ob- tuvo con la fórmula; ICR = ICA prueba/ ICA control. Interpretando el ICR>1 como resultado altamente favorable para el me- dio prueba.
Análisis estadístico
Con el fin de probar si existían diferencias en la proporción de productividad (ICA e ICR) se realizó una prueba de hipótesis para la proporción a un nivel de significancia del 5%, y para determinar la capacidad que tiene el medio prueba de recuperar cepas, se probó la hipótesis de:
Ho = La proporción de cepas con ICR ma- yor o igual a 1 es mayor o igual a 80%.
H1 = la proporción de cepas con ICR ma- yor o igual a 1 es mayor a 80%.
RESULTADOS
Concentración de agar-agar
Los resultados de los ensayos preliminares demostraron que las mejores consistencias fueron las concentraciones de 5,0, 4,5 y 4,0%; debido a que los resultados obteni- dos fueron muy similares, se tomó la menor concentración (4,0%) para un mejor apro- vechamiento del agar. El aspecto del agar en todas las concentraciones fue transpa- rente y sin precipitados, obteniéndose re- sultados igualmente satisfactorios.
Pruebas microbiológicas
No se observó crecimiento de S. epidermi- dis, E. coli y B. bronchiseptica en los me-
dios que sólo contenían agar y a los cuales no se les adicionó ningún tipo de nutrientes. Esto demuestra que el agar-agar producido no contiene nutrientes que favorezcan el crecimiento de las bacterias.
Método ecométrico
Los resultados obtenidos mediante el método ecométrico permitieron evaluar los medios elaborados con agar de G. cylin- drica y G. mammillaris y compararlos con los medios preparados con agares comer- ciales. Los valores de ICA e ICR (valores no mostrados) permitieron clasificar los microorganismos en productividad baja, media o alta (tabla 1).
La tabla 2 muestra la proporción de mi- croorganismos con resultados de alta y me- diana productividad para los medios preparados con agares de las dos especies de algas G. cylindrica y G. mammillaris y los controles comerciales (1 y 2). Estos re- sultados no evidenciaron diferencias estadísticamente significativas (tabla 3).
Con respecto a la comparación de la pro- porción de cepas recuperadas por el me- dio de G. cylindrica y con los controles 1 y 2 (ICR =1), no se observó diferencia estadísticamente significativa en ambos casos (p = 0,90) y (p = 0,69) respectivamen- te. En cuanto a la proporción de cepas re- cuperadas por el medio de G. mammillaris con respecto a los controles 1 y 2 (ICR =1) tampoco se observó diferencia significati- va (p= 0,99) y (p=0,32) respectivamente. Los resultados se muestran en la tabla 4.
DISCUSIÓN
La concentración óptima de agar-agar para lograr la gelificación de los medios de cul- tivo en este estudio fue alta (4%) compara- da con la concentración de los agares comerciales 1,5%. A este respecto podemos decir que es influenciada por el método de
Julio-diciembre 2007
extracción y el tipo de alga procesada, ya que el método ácido de extracción no fue eficiente para este tipo de algas, lo que in- dica que otros métodos de extracción de- ben ser ensayados para obtener una mayor fuerza de gelificación. Un estudio realiza- do en México por Freile-Prelegrín y Murano (2005), reporta la extracción de agar por método alcalino con de hidróxido de sodio, concluyendo que el agar presen- taba una buena fuerza gelificante compa- rable con la calidad del agar comercial, demostrando que el tratamiento alcalino es más efectivo que el ácido, debido a que se reduce el contenido de sulfatos y aumenta la fuerza de gel.
Los resultados demuestran que el méto- do ecométrico es adecuado para evaluar medios de cultivo microbiológico como lo confirman estudios realizados por Michanie (1992) quienes destacan las ventajas de este método como son la fa-
cilidad y rapidez de ejecución. Kornacki et al (2003) afirman que el método es una alternativa aceptable cuando se compara con otras más laboriosas e ineficientes.
Las pruebas estadísticas que se realizaron para demostrar la productividad de los me- dios en estudio, indicaron que no existie- ron diferencias entre éstos y los controles poniendo de manifiesto que el agar prepa- rado con G. mammillaris y G. cilyndrica no afecta positiva o negativamente el medio de cultivo, confirmando que éstos son una materia prima adecuada para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio.
Con respecto a la capacidad de recupera- ción de los medios en estudio las pruebas no demostraron superioridad al comparar- las con los controles, sin embargo, dicha capacidad de recuperación es superior al 50% cuando se comparan los medios de G. mamamillaris y G. cilyndrica con el con-
Tabla 3 Significancia estadística de la proporción de cepas alta y medianamente productivas de los medios prueba con respecto a los controles
Tabla 4 Proporción de la capacidad de recuperación de los medios en estudio con respecto a los controles
Medios a comparar Valor de p IC 95%
G. mammillaris vs Control 1 0,37 0- G. mammillaris vs Control 2 0,63 0- G. cylindrica vs Control 1 0,67 0- G. cylindrica vs Control 2 1,0 0-
Medios a comparar ICR > 1 IC 95% Valor de p
G. mammillaris vs Control 1 52,3 31-73 0, G. mammillaris vs Control 2 68,2 52-91 0, G. cylindrica vs Control 1 66,6 45-90 0, G. cylindrica vs Control 2 75,0 53-96 0,
Universitas Scientiarum, Vol 12, edición especial III, 57-
trol 2, lo que indicaría una mayor similitud del agar en estudio con el control 2 aunque es desconocida el alga de la cual se obtie- nen los agares comerciales.
CONCLUSIONES
La productividad de los medios nutritivos preparados con los agares obtenidos de las especies G. mammillaris y G. cilyndrica se comporta de manera similar a los contro- les.
La proporción de cepas recuperadas (resul- tados de ICR =1) por el medio de G cylíndrica y de G. mammillaris con respec- to al control 1 y al control 2, no superó el 80%.
Los resultados demuestran que el agar-agar obtenido de las algas en estudio no es tóxi- co para los microorganismos y se comporta de forma inerte en el medio de cultivo pre- parado, siendo un soporte para la gelifica- ción de medios sólidos.
AGRADECIMIENTOS
Este artículo se originó del proyecto n° 1571 financiado por la Fundación para la Pro- moción de la Investigación y la Tecnolo- gía – Banco de la República y del proyecto 1373 financiado por la Vicerrectoría Aca- démica de la Pontificia Universidad Jave- riana. Los autores agradecen a las entidades antes mencionadas el apoyo recibido para realizar este trabajo.
LITERATURA CITADA
CALDERÓN, L. y VILLALOBOS, A. Determinación de la productividad del agar microbiológico a partir de algas rojas ( Gracilaria mammillaris ) con diferentes especies bacterianas, trabajo de grado, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2003.
COELLO, S. Extracción de agar a partir de algas rojas pertenecientes al género Gracilaria a nivel de laboratorio, trabajo de grado, Fundación Univer- sidad de América, Bogotá, 2004.
COGNETTI, G., SARA, M. y MAGAZZU, G. Biología marina , 1 a^ edición, Bolo- gna, España, 2001, 619.
DÍAZ-PULIDO, G. y DÍAZ-RUIZ, M. Diver- sity of benthic marine algae of the Colombia Atlantic. Biota Colombiana , 2003, 4 (2), 203-46.
FIERRO, J y OTÁLORA, J. Determinación de la productividad de agar base Gracilaria cilíndrica , trabajo de grado, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2005.
FIGUEROA, C. Productividad del agar bacteriológico obtenido a partir de Gracilaria mammillaris , alga roja nativa del caribe colombiano, trabajo de grado, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, 2005.
FREILE-PELEGRÍN, Y., ROBLEDO, D. y GARCÍA-REINA, A. Seasonal agar yield and quality in Gelidium cariensis (Grunow) Seoane - Camba (Gelidiales: Rhodophyta) from Gran Canaria, Spain. Journal Applied Phycology , 1995, 7, 141-4.
FREILE-PELEGRÍN, Y. y MURANO E. Agars from three species of Gracilaria (Rhodophyta ) from Yucatán Peninsula. Bioresource technology , 2005, 96(3), 295-302.
KIRK, R_. Enciclopedia de tecnológica química_ , 1ª edición, Limusa, México, DF, México, 1998, 1494.
KORNACKI, J., GURTLER, J., YAN, Z. y COOPER, M. Evaluation of several modification of an ecometric tech-
