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1.1. LOS CULTIVOS INICIADORES
Las fermentaciones alimentarias, cuyo origen parece situarse en Oriente, datan de tiempos prehistóricos y representan una de las técnicas de conservación de alimentos más antiguas que existen. La fermentación supone la transformación microbiana de un producto mediante el catabolismo de los carbohidratos, proceso en el que se forman ácidos orgánicos, alcoholes y/o CO 2. Este proceso origina una modificación de las características organolépticas de las materias primas, obteniéndose una amplia gama de productos fermentados como el yogur, queso, mantequilla, embutidos, encurtidos, productos de panadería y diversas bebidas fermentadas.
Algunos de los microorganismos aislados de estas fermentaciones se han ido seleccionando para ser utilizados como cultivos iniciadores, que se definen como una o más cepas de una o más especies bacterianas, que se utilizan para inocular un producto crudo o pasterizado con el fin de iniciar su fermentación (Sandine, 1979).
De acuerdo con el número y tipo de cepas presentes, los cultivos iniciadores se clasifican en las siguientes categorías (Cogan, 1996; Mäyrä–Mäkinen y Briget, 1998):
- cultivo de cepa única , formado por una cepa de una determinada especie.
- cultivo definido múltiple , formado por varias cepas conocidas de una especie determinada.
- cultivo definido mixto , formado por varias cepas conocidas de distintas especies.
- cultivo indefinido o artesano , formado por numerosas especies y cepas, total o parcialmente desconocidas.
1.2. LAS BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO (BAL) Las bacterias lácticas o bacterias del ácido láctico (BAL) tienen en común la producción de dicho ácido como producto mayoritario del catabolismo de los azúcares. Son microorganismos Gram positivos, generalmente inmóviles, no esporulados, no pigmentados y no reductores de nitrato. Tampoco licuan la gelatina, no producen indol ni ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos. Debido a su limitada capacidad biosintética, son muy exigentes nutricionalmente y requieren factores de crecimiento complejos que incluyen aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas (Dellaglio et al. , 1994).
Estos microorganismos son anaerobios aero-tolerantes ya que, aunque en general carecen de catalasa, poseen otras peroxidasas y superóxido-dismutasa que permiten el crecimiento en condiciones de aerobiosis (Desmazeaud y Roissart, 1994).
Las BAL carecen del ciclo de Krebs, por lo que la generación de ATP ocurre mediante la fermentación de carbohidratos y compuestos relacionados, acoplada a fosforilación a nivel de sustrato. Entre los sustratos fermentables por las BAL se encuentran los azúcares (monosacáridos, disacáridos y polisacáridos), los polialcoholes, el citrato y algún aminoácido (arginina).
Este grupo comprende bacterias de los géneros Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Streptococcus , Enterococcus , Lactobacillus, Weissella y Carnobacterium. Aunque filogenéticamente alejados de las BAL, otros tipos bacterianos como son los géneros Micrococcus , Brevibacterium , Propionibacterium y Bifidobacterium también participan en la elaboración de alimentos fermentados. Las BAL están incluidas dentro del grupo de microorganismos “seguros” o GRAS ( generally recognized as safe ), lo que implica que pueden utilizarse para la elaboración de productos alimentarios.
El hábitat de estas especies es variado. Muchas aparecen asociadas a material vegetal. Otras forman parte de la microbiota normal del hombre y animales, encontrándose en los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, donde pueden ejercer un papel beneficioso al antagonizar la colonización por patógenos, mejorar la digestibilidad de algunos alimentos y actuar como coadyuvantes inmunológicos (Gilliland, 1990). 1.3. FUNCIONES DE LOS CULTIVOS INICIADORES La función principal de los cultivos iniciadores es la producción de ácido, principalmente láctico, como consecuencia de su metabolismo. Sin embargo, la contribución de los cultivos iniciadores a las características finales del producto no se limita al proceso de acidificación, sino que se completa con otras funciones como son la actividad proteolítica, la producción de compuestos aromáticos, la producción de CO 2 , la síntesis de exopolisacáridos o la producción de compuestos inhibidores (Chamba et al ., 1994).
láctico, acético y pirúvico debido a la inhibición por el oxígeno del enzima piruvato-formato-liasa (Abee et al. , 1982).
Vía heterofermentativa , propia del género Leuconostoc y de especies del género Lactobacillus del grupo III. La fermentación de la glucosa tiene lugar por la ruta de la fosfocetolasa, siendo éste el enzima clave de la misma. Los productos originados por esta vía son ácido láctico, CO 2 y cantidades variables de acético y etanol (fig. 1.2). El crecimiento de las bacterias con este tipo de metabolismo se ve favorecido en condiciones de aerobiosis ya que la regeneración de NAD+ consumido en la oxidación de la glucosa se realiza utilizando el oxígeno del medio como aceptor de electrones, lo que permite desviar el acetil-CoA hacia la síntesis de acético y generar una molécula extra de ATP.
En el caso concreto de la fermentación quesera, la producción de ácido origina la precipitación de las caseínas de la leche, aumenta la actividad del cuajo y mejora la sinéresis de la cuajada, todo lo cual conduce a una modificación de la materia prima, dando lugar al queso, con un pH y una actividad de agua menores y una vida útil más larga, ya que la acidificación actúa inhibiendo el crecimiento de microorganismos alterantes y/o patógenos. Además, la acidificación colabora en los procesos enzimáticos que tienen lugar durante la fase de maduración, interviniendo en las características finales del queso. 1.3.2. Actividad proteolítica El sistema proteolítico de la mayor parte de las bacterias lácticas consta de una única proteinasa extracelular con actividad caseinolítica, diversos transportadores de aminoácidos, transportadores de di- y tripéptidos y un transportador de oligopéptidos. El sistema se completa con aminopeptidasas y endopeptidasas intracelulares que intervienen en el último paso de la degradación (Christensen et al ., 1999), liberándose los aminoácidos esenciales para el desarrollo de las BAL.
La degradación de las proteínas de la leche constituye uno de los principales procesos durante la maduración de los quesos, interviniendo en la textura final del producto como consecuencia de la degradación de la trama proteica del coágulo
(De Jong, 1978), así como en el desarrollo de aromas y sabores por la liberación de péptidos y aminoácidos a partir de la caseína de la leche, que actúan como precursores del aroma (Thomas y Pritchard, 1987).
1.3.3. Producción de aromas Las bacterias del ácido láctico contribuyen al desarrollo del aroma de los productos fermentados mediante la producción de determinados compuestos (alcoholes, cetonas o ésteres) que actúan modificando las características organolépticas del producto. Así, la producción de diacetilo es necesaria para un correcto desarrollo del aroma en productos como la mantequilla y algunos quesos y leches fermentadas, mientras que el acetaldehído es el principal responsable del aroma del yogur (Vedamuthu, 1994). Otros volátiles como el ácido acético o las metilcetonas también intervienen en el desarrollo de aromas en diferentes variedades de quesos (Barron et al ., 2005).
FIGURA 1.2. Ruta heterofermentativa de utilización de lactosa de las bacterias del ácido láctico.
Como mencionamos anteriormente, la actividad proteolítica de algunas de estas especies (principalmente Lactococcus y Lactobacillus ) también contribuye al desarrollo de aromas y sabores por efecto de la degradación de las proteínas de la cuajada en péptidos y aminoácidos durante el proceso de maduración. Los aminoácidos actúan como sustratos en reacciones de transaminación, deshidrogenación, descarboxilación y reducción, produciendo una gran variedad de compuestos aromáticos como el ácido fenilacético, metanotiol, dimetildisulfuro, 3-metilbutirato, 3-metilbutanal, 3-metilbutanol, 2-metil-1- propanal o 2-metilbutanal, entre otros (Marilley y Casey, 2004). 1.3.4. Producción de exopolisacáridos Algunas bacterias lácticas tienen la capacidad de sintetizar polisacáridos extracelulares (EPSs). Se trata de polímeros de cadena larga y elevado peso molecular que se disuelven o dispersan en agua y que contribuyen a mejorar la textura y viscosidad del producto fermentado (De Vuyst y Degeest, 1999, Ruas- Madiedo, 2002a).
Además del interés por las propiedades reológicas de los EPSs, estos polímeros han sido objeto de numerosos estudios que han puesto de manifiesto características beneficiosas para la salud, tales como la estimulación del sistema inmune, actividad antitumoral o actividad reductora de los niveles de colesterol y antiulceral (Kitazawa et al ., 1991; Nakajima et al ., 1995; De Vuyst y Degeest, 1999). 1.3.5. Producción de gas La producción de CO 2 es especialmente relevante en microorganismos heterofermentativos como producto de la fermentación de azúcares. No obstante, también existe producción en especies homofermentativas como consecuencia del metabolismo del citrato.
Esta actividad es deseable en quesos de pasta “abierta” (Gruyére, Emmental, Gouda) y en quesos azules donde es necesaria la presencia de cavidades aireadas para permitir el desarrollo de los mohos (Chamba et al ., 1994).
1.4. DISEÑO DE NUEVOS CULTIVOS INICIADORES
Tradicionalmente, la elaboración de productos lácteos fermentados se ha basado en la acidificación espontánea de la leche provocada por el desarrollo de la microbiota presente de forma natural en la misma. Este sistema implicaba que la calidad del producto final dependía enormemente de la carga microbiana y de la variedad de microorganismos presentes en la leche. Para mejorar el proceso, se utilizaba como inóculo una pequeña porción de una fermentación previa, lo que favorecía la dominancia de las cepas bacterianas mejor adaptadas al proceso (Wouters et al ., 2002).
Aunque este sistema se utiliza todavía en algunas queserías artesanales, la producción de la gran mayoría de productos lácteos fermentados se basa en la utilización de cultivos iniciadores producidos industrialmente. El uso de los mismos resulta obligado cuando se utiliza como materia prima leche pasterizada en la que la microbiota original ha sido parcialmente destruida, pero también es habitual recurrir a la adición de fermentos comerciales a la leche cruda utilizada para elaborar quesos de largo periodo de maduración (más de 60 días), porque la notable mejora de la calidad higiénica de la leche implica que los niveles de la microbiota láctica sean relativamente bajos. En ambos casos, el uso de fermentos proporciona un alto grado de control sobre el proceso de fermentación.
El uso de este tipo de cultivos, junto con la utilización de métodos de procesado más higiénicos y condiciones de maduración controladas, ha tenido un efecto enormemente positivo en la calidad, proporcionando productos microbiológicamente más seguros y con unas propiedades organolépticas y reológicas más reproducibles. Sin embargo, como consecuencia de esta uniformidad y debido a que la posibilidad de elección entre los fermentos industriales disponibles en el mercado es limitada, se ha producido una pérdida paulatina de las características organolépticas típicas de cada producto lácteo que le proporcionaban la “singularidad”.
Hoy en día, los consumidores demandan cada vez más productos con sabor y aroma diferenciales, al mismo tiempo que buscan nuevas propiedades relacionadas con potenciales efectos beneficiosos para la salud. Por todo ello, la industria
agroalimentaria precisa desarrollar nuevos fermentos que respondan a dicha demanda. En este sentido, la búsqueda de nuevas cepas en ambientes naturales ha demostrado ser una buena estrategia para seleccionar microorganismos con propiedades relevantes, como la producción de perfiles aromáticos novedosos, producción de bacteriocinas, síntesis de exopolisacáridos o una mayor actividad proteolítica (Van den Berg et al ., 1995; Ayad et al ., 2000; Wouters et al ., 2002; Poveda et al ., 2003, Rilla et al ., 2004).
Varios autores han estudiado el uso de cepas silvestres como cultivos iniciadores o cultivos adjuntos para la elaboración de productos lácteos fermentados, obteniendo resultados satisfactorios. Cárcoba y Rodríguez (2004) elaboraron queso Afuega’l Pitu utilizando un fermento liofilizado compuesto por cepas “autóctonas” aisladas de quesos artesanales, demostrando la aptitud tecnológica de dicho fermento. González et al. (2003) compararon las características de queso elaborado con cultivos iniciadores comerciales y quesos elaborados con cepas “autóctonas” aisladas de queso de los Ibores, observando que estos últimos presentaban niveles menores de coliformes y estafilococos coagulasa positivos, al tiempo que mostraban unas características organolépticas similares a los elaborados con cultivos comerciales. Por otro lado, Gómez et al. (1999) compararon las características de un queso elaborado con un fermento mixto comercial con las de un queso elaborado con un cultivo definido mixto constituido por cepas aisladas de queso Manchego artesanal.
Este cultivo mostró una mayor supervivencia que el fermento comercial durante la fase de maduración, no observándose diferencias en cuanto a las características e intensidad de aroma del producto final. Alonso-Calleja et al. (2002) estudiaron el efecto de la pasterización y la adición de cultivos iniciadores procedentes de aislados de quesos tradicionales en las características organolépticas de queso de Valdeteja. Las características de apariencia, aroma y textura del queso fueron similares a las de quesos de elaboración tradicional.
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