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Producción y Aislamiento de Sideróforos desde Rahnella aquatilis: Un Agente de Biocontrol, Apuntes de Metodología de Investigación

Un estudio sobre la producción de sideróforos por parte de la bacteria rahnella aquatilis, un agente de biocontrol. Se explora la importancia de los sideróforos en la fisiología microbiana y su potencial en biotecnología. Las técnicas de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (uhplc) y espectrometría de masas en tándem (ms/ms) utilizadas para analizar y caracterizar los sideróforos producidos.

Tipo: Apuntes

2011/2012

Subido el 31/03/2025

maria-evangelina-guinez
maria-evangelina-guinez 🇦🇷

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
Curso de Actualización Profesional: “Metodología de la Investigación y
Análisis Cuantitativo de Dato”
Tema: “Producción y aislamiento de sideróforos desde Rahnella aquatilis, un
agente de biocontrol; y su análisis mediante cromatografía líquida de ultra
elevado rendimiento, acoplada a espectrometría de masas en tándem”
Autor: María Evangelina Guiñez. Licenciada en Química de la UNSL.
OBJETIVO
El objetivo principal del presente trabajo fué estudiar la producción de
sideróforos desde Rahnella aquatilis y contribuir al análisis de reconocimiento,
separación y detección de estos compuestos mediante técnicas de alto impacto
científico como lo son la separación cromatográfica de ultra elevado rendimiento
asociada a la determinación mediante espectrometría de masas en tándem.
INTRODUCCIÓN
1. Sideróforos:
El hierro es un micronutriente esencial involucrado en muchos procesos
bioquímicos en los microorganismos. La existencia de dos estados de oxidación, (Fe2+)
ferroso y (Fe3+) férrico, dentro del rango redox fisiológico dan al hierro su capacidad
para actuar como transportador de electrones. A pesar de que el hierro es bastante
abundante en la naturaleza, la insolubilidad del ion férrico (Fe3+) hace su adquisición
dificultosa para los microorganismos.
Debido a esta baja disponibilidad de hierro, muchos microorganismos han
desarrollado mecanismos específicos para su adquisición ya sea desde el suelo, la
filósfera, ambientes acuáticos o tejidos de huéspedes animales. El mecanismo es
esencialmente el siguiente: el microorganismo produce un agente quelante de bajo peso
molecular que excreta al medio. Estos agentes quelantes son llamados “sideróforos”. El
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS

Curso de Actualización Profesional: “Metodología de la Investigación y

Análisis Cuantitativo de Dato”

Tema: “Producción y aislamiento de sideróforos desde Rahnella aquatilis , un

agente de biocontrol; y su análisis mediante cromatografía líquida de ultra

elevado rendimiento, acoplada a espectrometría de masas en tándem”

Autor: María Evangelina Guiñez. Licenciada en Química de la UNSL.

OBJETIVO

 El objetivo principal del presente trabajo fué estudiar la producción de

sideróforos desde Rahnella aquatilis y contribuir al análisis de reconocimiento,

separación y detección de estos compuestos mediante técnicas de alto impacto

científico como lo son la separación cromatográfica de ultra elevado rendimiento

asociada a la determinación mediante espectrometría de masas en tándem.

INTRODUCCIÓN

1. Sideróforos:

El hierro es un micronutriente esencial involucrado en muchos procesos

bioquímicos en los microorganismos. La existencia de dos estados de oxidación, (Fe2+)

ferroso y (Fe3+) férrico, dentro del rango redox fisiológico dan al hierro su capacidad

para actuar como transportador de electrones. A pesar de que el hierro es bastante

abundante en la naturaleza, la insolubilidad del ion férrico (Fe3+) hace su adquisición

dificultosa para los microorganismos.

Debido a esta baja disponibilidad de hierro, muchos microorganismos han

desarrollado mecanismos específicos para su adquisición ya sea desde el suelo, la

filósfera, ambientes acuáticos o tejidos de huéspedes animales. El mecanismo es

esencialmente el siguiente: el microorganismo produce un agente quelante de bajo peso

molecular que excreta al medio. Estos agentes quelantes son llamados “sideróforos”. El

fenómeno también se reproduce en medios de cultivo de laboratorio, particularmente

cuando el medio posee bajo contenido de hierro.

La mayoría de los microorganismos aeróbios y anaeróbios facultativos

producen al menos un sideróforo, cuando crecen en condiciones de carencia del

mencionado metal.

La importancia de los sideróforos se extiende mas allá de su rol inmediato en la

fisiología microbiana y actualmente están siendo desarrolladas sus aplicaciones en

biotecnología ya que son un amplio grupo de materiales inusuales, cuyo potencial en el

mundo comercial de la biotecnología está listo para su explotación.

Los sideróforos son moléculas especiales, muchos contienen aminoácidos

modificados y no se encuentran en otro lugar en la naturaleza. A diferencia de las

enzimas y otras macromoléculas las cuales permanecen constantes a través de un rango

de microorganismos, se ha visto una gran variación en estructura de sideróforos desde

una especie a otra.

En general los sideróforos se clasifican en dos grupos estructurales principales:

 Catecolatos, o fenolatos que producen las bacterias.

 Hidroxamatos, los cuales son producidos por hongos y bacterias.

2. Espectrometría de masas:

La espectrometría de masas se basa en la determinación de la masa de las

moléculas en función de la relación de masa/carga (m/z) de sus iones, permite obtener el

peso molecular de estas moléculas lo cual conduce a la posibilidad del análisis

cuantitativo y cualitativo de compuestos conocidos y desconocidos utilizando pequeñas

cantidades de muestra (normalmente en el orden de los picogramos). El proceso de la

espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas: a) ionización de la

muestra, b) aceleración de los iones por un campo eléctrico, c) dispersión de los iones

según su masa/carga y, por ultimo, d) detección de los iones y producción de la

correspondiente señal o espectro de masas.

2.1 Espectrometría de masas en tándem:

El acoplamiento de dos analizadores de masas o espectrometría de masas tándem

(MS/MS) puede ser muy ventajoso a la hora de identificar compuestos en muestras

complejas y determinar estructuras de compuestos desconocidos. Un equipo de MS/MS

está constituido de seis componentes básicos: 1) sistema de introducción de muestra; 2)

3. Cromatografía líquida:

La cromatografía líquida (LC: Liquid Chromatography) es una técnica de

separación donde los analitos son resueltos en virtud de sus diferentes solubilidades

entre la fase móvil y un líquido o sólido de la fase estacionaria. Cromatografía líquida

de alto o elevado rendimiento (HPLC: High Performance Liquid Chromatography)

utiliza una fase líquida móvil para separar los componentes de una mezcla. Estos

componentes o analitos son primero disueltos en un solvente y luego forzados a fluir a

través de la columna cromatográfica en un sistema de alta presión. En la columna, los

analitos de la mezcla son separados o resueltos cromatográficamente. Además de

alcanzar una buena separación analítica, el acoplamiento HPLC/MS permite mejorar los

límites de detección y la calidad de los resultados del espectrómetro de masas al reducir

la señal de fondo.

3.1 Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento

En los últimos años, una de las alternativas para mejorar la resolución y

eficiencia cromatográficas y disminuir en forma notoria el tiempo de análisis es

mediante el uso de columnas de tamaño de partículas pequeñas, menores a 2 μm, las

cuales son empleadas para lo que hoy se conoce como cromatografía líquida de ultra-

alto rendimiento -o presión- (UHPLC: Ultra High Pressure Liquid Chromatography).

Columnas rellenas con partículas menores a 2 μm permiten obtener picos

cromatográficos mas delgados, lo cual resulta no solo en una mejor resolución, sino

también en mejores límites de detección. La instrumentación para UHPLC requiere

componentes similares a aquellos utilizados para la cromatografía de HPLC

convencional; sin embargo, el uso de columnas con tamaño de partículas menores a 2

μm genera elevadas presiones en el sistema (10,000–15,000 psi) y requiere

componentes, tales como bombas, especiales para UHPLC. Las ventajas del uso de este

tipo de columnas se relacionan rapidez del análisis, desarrollo y validación de las

metodologías, uso reducido de solventes e incremento de la sensibilidad de la

espectrometría de masas, entre otras.

ACTIVIDADES

1. Investigar la producción de quelantes de hierro (sideróforos) con estructura tipo

catecolato y/o tipo hidroxamato por parte de la cepa Rahnella aquatilis.

1.1 Producción de sideróforos en medios líquidos con la cepa Rahnella

aquatilis.

1.2 Detección de sideróforos en los sobrenadantes de los cultivos.

2. Análisis de la influencia de diversos factores sobre la producción de sideróforos

(composición del medio de cultivo, aireación, etc.)

3. Optimización de la separación cromatográfica y de las condiciones de ionización

y fragmentación de las moléculas de los analitos de interés para la obtención de

información estructural de los compuestos bajo estudio.

El tratamiento estadístico de los datos experimentales, se realizó por medio de

pruebas paramétricas y en algunos casos se realizó la comparación de resultados con

pruebas no paramétricas.

RESULTADOS

1. Investigar la producción de quelantes de hierro (sideróforos) con

estructura tipo catecolato y/o tipo hidroxamato por parte de la cepa Rahnella

aquatilis.

1.1 Pruebas preliminares

Se realizaron pruebas preliminares de producción de sideróforos, con dos medios

de cultivo propuestos por Neilands, J. (Messenger & Ratledge, 1985), para verificar la

producción de sideróforos de tipo hidroxamato y catecolato. Los ensayos se llevaron a

cabo con el ACB (agente de control biológico) Rahnella aquatilis, en frascos

Erlenmeyer de 500 ml de capacidad, con 125 ml de medio de cultivo; agitados a 200

rpm y 28 + 1 °C; durante 48 horas. A las 24 y 48 horas se tomaron alícuotas de 3 ml, se

centrifugaron a 15000 rpm durante 10 minutos, se separaron las células para la

determinación de peso seco y en los sobrenadantes se realizaron las determinaciones de

Tabla 2 Medidas de absorbancia empleando el Ensayo de Arnow para soluciones

de diferente concentración de enterobactina patrón

Concentración

patrón enterobactina

Absorbancia

Se presenta a continuación el tratamiento estadístico y la curva de calibrado

obtenida para el método de detección de catecoles propuesto por Arnow empleando el

Modelo estadístico de Análisis de Regresión Lineal.

Análisis de regresión lineal

Variable N R²

Absorbancia 21 0,

Coeficientes de regresión y estadísticos asociados

Coef Est. E.E. LI(95%) LS(95%) T p-valor CpMallows

const 0,0191 0,0036 0,0115 0,0267 5,2453 <0,

Concentr 0,0083 4,7E-05 0,0082 0,0084 175,6952 <0,0001 29326,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 3,5882 1 3,5882 30868,8106 <0,

Concentr 3,5882 1 3,5882 30868,8106 <0,

Error 0,0022 19 0,

Total 3,5904 20

Los estimadores de los parámetros (coeficientes) del modelo lineal son a = 0,

(estimador de ordenada al origen) y b=0,0083 (estimador de pendiente). Desde el

cuadro de ANAVA se desprende que el Modelo explica una parte significativa de la

variabilidad de los datos el p-valor (<0,0001) asociado a la hipótesis nula, que postula

que las variaciones en la producción de catecol (mg/L) no son explicadas por la relación

lineal con la concentración del patron, induce al rechazo de esta hipótesis. El coeficiente

de determinación obtenido es R^2 = 0.999, es decir el 99% de la suma de cuadrados

totales de la variable dependiente (Absorbancia) es explicada, a través de una relación

lineal, por la variación observada en la variable independiente (concentración de

enterobactina).

Figura 1 Curva de calibrado de enterobactina.

1.3 Elección del medio de cultivo

Posteriormente a fin de elegir el mejor medio para la producción del catecol se

probaron tres medios de cultivo diferentes:

1- Medio de producción de enterobactina

2- YGM (yeast glucose medium)

3- VF (vitamin free)

Todos los medios fueron ensayados según la metodología descripta en el punto

1.1, previo desferrado con 8-hidroxiquinolina en cloroformo y también sin desferrar.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil 0 26 52 78 103 129 155 Concentración de enterobactina 0, 0, 0, 1, 1, Absorbancia

y = 0,0191 + 0,0083 x

Para estudiar el cumplimiento de estos supuestos de ANOVA se recurre a

métodos gráficos (QQ-plot para normalidad, Residuos vs predichos para

homocedasticidad), Prueba de Normalidad de Shapiro-Wilks (modificado), Prueba de

Levene (homocedasticidad)

a- Normalidad

Figura 2: Gráficos Q-Q plot. Medidas de producción de catecol, a las 24 h y 48 h de

incubación, en diferentes medios de cultivo.

Prueba de Shapiro-Wilks (modificado)

H 0 : los residuos tienen distribución normal versus

H 1 : los residuos no tienen distribución normal.

tpo inc (h) Variable n Media D.E. W* p(Unilateral D)

24 RDUO_[catecol] 6 0,00 8,40 0,86 0,

48 RDUO_[catecol] 6 0,00 7,91 0,92 0,

En este caso no hay evidencias para rechazar el supuesto de

distribución normal ( p =0,2343 y p=0,5988).

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Cuantiles de una Normal
Cuantiles observados (RDUO_[catecol])

(^) n= 6 r= 0,958 (RDUO_[catecol]-24) n= 6 r= 0,984 (RDUO_[catecol]-48)

Q-Q plot

b- Homogeneidad de varianzas

Figura 3: Gráficos residuos vs predichos. Medidas de producción de catecol, a las 24 h y

48 h de incubación, en diferentes medios de cultivo.

Prueba de Levene: Análisis de la varianza

tpo inc (h) Variable N R² R² Aj CV

24 RABS_[catecol] 6 0,58 0,00 50,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 44,90 3 14,97 0,90 0,

Medio 27,07 2 13,54 0,82 0,

tecn 17,83 1 17,83 1,08 0,

Error 33,15 2 16,

Total 78,05 5

tpo inc (h) Variable N R² R² Aj CV

48 RABS_[catecol] 6 0,66 0,15 52,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

H 0 : Las varianzas son iguales

H 1 : Al menos dos varianzas son distintas.

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 60,75 3 20,25 1,29 0,

Medio 51,86 2 25,93 1,66 0,

tecn 8,89 1 8,89 0,57 0,

Error 31,32 2 15,

Total 92,07 5

En este caso hay evidencias para rechazar el supuesto de varianzas

distintas respecto al medio de cultivo y la técnica empleada.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

PRED_[catecol]
RDUO_[catecol]
Grafico de Dispersión

C- Medidas de Resumen

Medidas resumen

tiempo incub Variable n Media D.E. Mín Máx P(95)

24 Medio 3_s/def 2 77,09 1,68 75,90 78,27 78,

24 Medio 3_desf 2 61,71 0,41 61,42 62,00 62,

Los resultados mostrados anteriormente obtenidos de pruebas paramétrica como

para pruebas no paramétricas, muestran a partir del valor-p en caso se acepta la H 1 , hay

al menos un tratamiento a las 24hs y 48hs que presenta diferencias significativas en la

producción de catecol, las pruebas a posteriori indican que el medio de cultivo 3 esto es

medio VF es el que presenta mayores producciones del catecol. Observando las medias

en la tabla Medidas de resumen, se seleccionó el Medio Vitamin free sin desferrar, con

24 h de incubación, para subsiguientes estudios, debido a que fue el medio en el que se

obtuvieron mejores resultados en la producción del analito de interés y el mismo no

requiere ser desferrado, el cual es un método caro y engorroso.

2. Análisis de la influencia de diversos factores sobre la producción de

sideróforos

Se estudio el efecto de diferentes fuentes de carbono adicionales a glucosa o en

reemplazo de la misma en el medio de producción del catecol. En todas las pruebas se

siguió la metodología descripta en el punto 1.1.

2.1 Influencia de diferentes fuentes de carbono:

Para estudiar el efecto de diferentes fuentes de carbono sobre la producción del

catecol se utilizó sustancias que estimularan el metabolismo aeróbico del

microorganismo y por consiguiente la necesidad de hierro. Se realizaron ensayos en la

forma antes mencionada (punto 1.1) reemplazando en el medio Vitamin free, 5 gr de

glucosa por 5 gr de succinato y el total de la glucosa por igual cantidad de lactosa y

glicerol. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Medidas de producción de catecol a las 24 h de incubación, en medio

VF con diferentes fuentes de carbono.

MEDIO VF CONCENTRACIÓN DE CATCOL (mg/L)

GLU 56,26 65,43 66,23 58,86 58,86 57,

LAC 121,45 121,81 127,52 120,08 137,42 147,

GLIC 88,98 93,01 81,71 78,97 89,78 78,

GLU+SUCC 88,13^ 88,10^ 82,66 84,69 91,11^ 88,

A continuación se realizó un estudio estadístico descriptivo y para ello se

elaboró un gráfico de barras y un gráfico de cajas.

Figura 2: Gráfico de barras. Medidas de producción de catecol y biomasa por Peso Seco, a las

24 h de incubación, en medio VF y VF con diferentes fuentes de carbono.

Como se observa en la gráfica anterior el uso de Glicerol y Succinato en el

medio de cultivo VF, estimularon la producción de catecol, pero Lactosa resultó ser la

mejor fuente de carbono para producir este sideróforo.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Glu Lac Glic Glu+Succ

Fuente de C

44, 74, 103, 133, 163,

Catecol (mg/L)
Grafico de barras

bacteria en estudio, empleando el medio de cultivo VF con diferentes fuentes de

carbono (Fte de C).

A- ANOVA

H 0 : No hay diferencias significativas en la producción de catecol (mg/L) usando

diferentes fuentes de carbono en la formulación del medio de cultivo VF

(Glu).

H 1 : Si hay diferencias significativas en la producción de catecol (mg/L) usando

diferentes fuentes de carbono en la formulación del medio de cultivo VF

(Glu).

Análisis de la varianza

Variable N R² CV

[Catec] 24 0,94 7,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 14699,19 3 4899,73 103,46 <0,

Medio 14699,19 3 4899,73 103,46 <0,

Error 947,16 20 47,

Total 15646,35 23

Dado que el valor p asociado a la hipótesis de efecto nulo del uso de diferentes

fte. de C es <0.0001 se rechaza la hipótesis nula y se concluye, trabajando con un nivel

de significación del 5%, que al menos un tratamiento tiene efecto no nulo. Se realiza la

prueba de “a posteriori” de Fisher:

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=8,

Error: 47,3579 gl: 20

Medio Medias n E.E.

Glu 60,51 6 2,81 A

Glic 85,18 6 2,81 B

Glu+Succ 87,22 6 2,81 B

Lac 129,38 6 2,81 C

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0,05)

Para realizar esta prueba se supone que la variable aleatoria es normal,

independientemente distribuida con esperanza cero y varianza σ^2. Para estudiar el

cumplimiento de estos supuestos se recurre a métodos gráficos (QQ-plot para

normalidad) y la Prueba de Normalidad de Shapiro-Wilks (modificado).

a- Normalidad

Figura 4: Gráficos Q-Q plot. Medidas de producción de catecol, a las 24 h de incubación, en

medio VF (Glu) y VF con diferentes fuentes de carbono.

Shapiro-Wilks (modificado)

Medio Variable n Media D.E. W* p(Unilateral D)

Glic [Catec] 6 85,18 6,17 0,85 0,

Glu [Catec] 6 60,51 4,24 0,81 0,

Glu+Succ [Catec] 6 87,22 3,03 0,93 0,

Lac [Catec] 6 129,38 11,14 0,83 0,

Dados los valores-p (mayores a α= 0,05) se acepta H 0 : La producción

de catecol para cada fuente de carbono empleada tienen distribución

normal.

b- Homocedasticidad

Prueba de Levene: Análisis de la varianza

Variable N R² R² Aj CV

RABS_[Catec] 24 0,44 0,35 60,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

H 0 : Las varianzas son iguales

H 1 : Al menos dos varianzas son distintas.

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 145,81 3 48,60 5,14 0,

Medio 145,81 3 48,60 5,14 0,

Error 189,12 20 9,

Total 334,93 23

En este caso hay evidencias para aceptar el supuesto de varianzas

iguales respecto al medio de cultivo empleado.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Cuantiles de una Normal

Cuantiles observados ([Catec])

n= 6 r= 0,950 ([Catec]-Glic) n= 6 r= 0,923 ([Catec]-Glu) n= 6 r= 0,963 ([Catec]-Glu+Succ) n= 6 r= 0,925 ([Catec]-Lac)

Q-Q plot

3.1 Efecto de la adición de búfer a la fase móvil

Dada las características químicas de enterobactina y con el fin de favorecer la

protonación de los grupos funcionales de su estructura, se decidió trabajar con los

solventes de la fase móvil (agua y acetonitrilo) acidificados. En estas condiciones, se

favoreció la formación del ión molecular tipo [M+H]+^ en la fuente de ionización ESI y

su posterior detección masas. Como resultado de lo anteriormente mencionado, se

decidió evaluar el efecto de la adición y de la concentración de diferentes búferes ácidos

a la fase móvil, tales como ácido acético y ácido fórmico, sobre la respuesta de la señal

de Enterobactina patron. Es importante destacar que estos dos ácidos son normalmente

utilizados en espectrometría de masas, dado su fácil evaporación y compatibilidad con

las condiciones de ionización, ya que los mismos no forman depósitos salinos; también

se estudió la respuesta del analito sin agregado de ácido a la fase móvil. Los resultados

obtenidos se presentan a continuación en la figura 5.

Figura

5 Efecto de la adición y no adición de buffer a la fase móvil sobre la respuesta de Enterobactina.

(Los valores representados corresponden al valor medio de mediciones realizadas por triplicado ±

SD (desviación estándar de las mediciones)).

De la figura anterior es posible observar que el agregado de un ácido mejora

notablemente la respuesta del analito. En este sentido, ácido acético y ácido fórmico

demostraron un comportamiento similar. A continuación se presenta el análisis

estadístico correspondiente.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil s/buffer ác fórmic ác acétic

Buffer
Respuesta (%)
Gráfico de barras

A- ANOVA

H 0 : No hay diferencias significativas en la señal (%) que proporciona el equipo

empleado usando diferentes buffer ácidos en la fase móvil.

H 1 : Si hay diferencias significativas en la señal (%) que proporciona el equipo

empleado usando diferentes buffer ácidos en la fase móvil.

Análisis de la varianza

Variable N R² R² Aj CV

Respuesta (%) 9 1,00 1,00 1,

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 4532,67 2 2266,33 1854,27 <0,

Buffer 4532,67 2 2266,33 1854,27 <0,

Error 7,33 6 1,

Total 4540,00 8

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=2,

Error: 1,2222 gl: 6

Buffer Medias n E.E.

s/buffer 49,00 3 0,64 A

ác acétic 94,67 3 0,64 B

ác fórmic 98,33 3 0,64 C

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0,05)

A partir de los resultados anteriores se rechaza H 0 y por la prueba a posteriori de

Fisher se seleccionó ácido fórmico para posteriores experimentos.

Además, se estudió el efecto de la concentración del ácido fórmico adicionada a

la fase móvil en función de la respuesta de Enterobactina (Figura 4).

Figura 4 Efecto de la concentración de ácido fórmico sobre la respuesta de

Enterobactina.

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

[ác formic] (% v/v)
Respuesta (%)
Gráfico de puntos