Manual de Prácticas de Microbiología y Parasitología: MED 126 L, Ejercicios de Microbiología Ambiental

¡Descarga Manual de Prácticas de Microbiología y Parasitología: MED 126 L y más Ejercicios en PDF de Microbiología Ambiental solo en Docsity!

Manual de prácticas de

Microbiología y Parasitología

MED 126 L

Autores Manual Original: Lic. Magnolia Lluberes Dra. Zurina Romay Actualización Manual: Dra. Ruth P. Santos Dr. Mario Valdez Lic. Guadalupe Alonzo

Normas de bioseguridad Debido a que en los laboratorios se utilizan materiales cortopunzantes como lancetas, jeringas, bisturís y se manipulan sustancias químicas, sangre y fluidos biológicos humanos, que pueden crear un ambiente sumamente desfavorable por el riesgo de contraer enfermedades infectocontagiosas o producir heridas que pueden constituirse como puerta de entrada para agentes patógenos; es necesario tomar en cuenta las siguientes precauciones en las prácticas:

1. Usar siempre bata para evitar contacto con su piel o ropa con sustancias irritantes o líquidos potencialmente infectados
2. Usar siempre guantes para todo procedimiento en los que impliquen el contacto con sangre, tejidos y fluidos corporales.
3. Usar mascarilla y gafas de protección durante los procedimientos que generen gotas de sangre o líquidos corporales previniendo así la exposición de la mucosa oral, nariz y ojos.
4. Lavarse las manos inmediatamente antes y después de realizar cualquier procedimiento o de tener contacto con sangre o líquidos corporales.
5. Evitar participar de cualquier procedimiento en donde pueda tener contacto con sangre o fluidos corporales cuando presente piel no intacta tipo abrasiones o dermatitis.
6. Poner especial atención en la manipulación de los utensilios de trabajo de manera que se puedan evitar los accidentes con agujas, bisturí y cualquier elemento cortopunzante; para ellos se recomienda de absoluta concentración durante las actividades para así evitar cualquier tipo de accidente.
7. Descartar los objetos desechables contaminados con fluidos biológicos o cortopunzantes en los recipientes correspondientes para este fin.
8. Nunca debe pipetear con la boca, este procedimiento se realiza siempre con aditamentos mecánicos adecuados.
9. No se permite entrar a las áreas del laboratorio con ningún tipo de alimentos, bebidas o cigarrillos a menos que estos sean parte del proyecto del laboratorio que va a ser realizado.
10. No se permite depositar en los zafacones de los laboratorios desechos de alimentos o desechos de cualquier otra índole que procedan de otras áreas.

INDICE

• PRÁCTICA Unidad de Microbiología
• Bioseguridad Materiales necesarios para el procesamiento de las muestras…….. Presentación del laboratorio de Microbiología. Trabajo aséptico y reglas de
• Práctica #
• Microscópicos y macroscópicos para identificar microorganismos…………………. Toma de muestra y siembra primaria, La resiembra; cultivos puros. Criterios
• Práctica #
• Identificación de Gram positivo…………………………………………………………1
• Práctica #
• Identificación de Cocos Gram Negativo……………………………………………......
• Práctica #
• Identificación de hongos………………….…………………………………………....…2
• Práctica #
• Identificación de Mycobacterias………………………………………………………….3
• Práctica #
• Pruebas de sensibilidad a los antibióticos; antibiograma……………………………..4

incubadora (^) Horno HORNO Asas y agujas ALAMBRES Y ASAS DESIEMBRA

2. Equipos y accesorios propios para el trabajo con M. O.
   • equipos: • accesorios: Autoclave horno incubadora flujo laminar microscopio óptico alambres de siembra (asa y aguja) frascos de cultivo (tubos, placas Petri) portaobjetos y cubreobjetos
3. Un área para depositar el material contaminado
4. Lavamanos, con jabón desinfectante y papel toalla
5. Frasco spray con solución desinfectante
   • Objetivos para la manipulación aséptica: 1ro. Evitar que los M. O. Ubicuos interfieran en el aislamiento e identificación de los m. O. Presentes en las muestras estudiadas 2do .Evitar que los patógenos contenidos en las muestras nos infecten Reglas o normas de bioseguridad para cumplir con el trabajo aseptico: 1. Uso de bata sanitaria, guantes y bozal 2. Evitar salpicaduras de las muestras y de los cultivos que manipulados 3. Desinfectar la meseta de trabajo antes y después de la manipulación 4. Depositar todos los materiales que se descarten en soluciones germicidas, o esterilizarlos en autoclave 5. no se debe ingerir alimentos en el laboratorio 6. No se deben depositar objetos personales en las mesetas de trabajo 7. Durante el trabajo evite tocarse con las manos contaminadas IV: parte experimental IV.1 materiales procedimiento A) Dibuje dentro del recuadro el esquema de los siguientes equipos y accesorios: Autoclave TUBO DE CULTIVO Y PLACA DE PETRI

Destaque las partes fundamentales del microscopio óptico que usted observó en esta práctica IV.2 CUESTIONARIO: A) Observa el material didáctico sobre trabajo aséptico. Describe tres reglas de bioseguridad. 1._________________________________________________________________ 2._________________________________________________________________

---

3._________________________________________________________________ B) Que información sobre el pacte. Debe trasmitir el medico al laboratorista?

---

---

---

C) En que se diferencia la manipulación de bacterias y hongos patógenos con el manejo de los virus en el laboratorio de microbiología.

---

---

---

D) Que debemos utilizar para enfocar con el objetivo de inmersión (100x)

---

E) Menciones tres desinfectantes que se recomiendan para el trabajo con M.O.

---

---

F) Que materiales se pueden esterilizar en el autoclave?

Especiales Su composición cumple con los requerimientos nutricionales vitales de un microorganismo determinado, que solo en ese medio encuentra condiciones óptimas para su desarrollo. Los medios de cultivo se adquieren en el mercado deshidratado y traen especificaciones de la cantidad que hay que pesar para un litro de agua. Toda la cristalería que se usa debe estar limpia y libre de detergente. PASOS A SEGUIR EN LA PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS : 1ro. Se pesa la cantidad de medio deshidratado necesario para el volumen de agua a preparar. 2do. Se mide en un cilindro graduado la cantidad de agua destilada. 3ro. Se vierte el agua en el recipiente de preparación, se añade el polvo deshidratado y se mezcla hasta la disolución completa, los medios que contienen agar necesitan ser calentados hasta la ebullición para lograr su disolución. 4to. Por último, los medios se distribuyen en los frascos de cultivos antes de esterilizarlos en autoclave. Los medios líquidos y semisólidos se distribuyen en tubos y quedan en posición vertical. Los medios solidos se distribuyen en tubos y después de esterilizarlos aun calientes se colocan sobre un plano inclinado para que al enfriarse queden en ¨punta de flauta ¨ (observándose 2 regiones: la superficie y la profundidad), el medio que se destina aplacas se esteriliza primero y aún caliente se vierte sobre las placas estériles. 5to. Los medios preparados deben ser incubados por 24hrs antes de utilizarlos para controlar su esterilidad Esterilización en autoclave: Este método se basa en aplicar sobre el material a esterilizar vapor de agua sobrecalentado por estar sometido a sobrepresión. La temperatura que alcanza el vapor con sobrepresión de 1 atm equivale a 121 ̊c, el tiempo de esterilización depende del volumen del material a esterilizar, los medios de cultivo se esterilizan siguiendo las recomendaciones del fabricante. PASOS A SEGUIR EN EL MANEJO DEL AUTOCLAVE: 1ro. Revisar el nivel de agua del equipo 2do. Introducir el material a esterilizar en la cámara de esterilización los materiales deben quedar espaciados para que el vapor pueda tocar los diferentes puntos de esa área.

3ro. Se cierra la autoclave y se comienza el calentamiento. La válvula de seguridad debe quedar abierta. 4to. Cuando comienza a salir a través de la válvula el vapor, se cierra y espera a que el agua del manómetro marque la temperatura y presión requeridas. 5to. Se mantienen esas condiciones de esterilización por el tiempo necesario al final del periodo se elimina el calentamiento. 6to. Se espera a que el manómetro vuelva a cero. I. PARTE EXPERIMENTAL a) Materiales Medios De Cultivo Deshidratados Baker (500ml) Placas Petri Estériles Tubos De Cultivo Mechero Con Trípode Y Malla De Amianto Varilla Cristal (Agitador) Balanza Erlenmeyer (500ml) Con Tapón De Algodón Y Retapa De Papel Cesta Metálica b) PROCEDIMIENTO B.1) preparar un medio de cultivo según te oriente el profesor Anota los ingredientes que componen la fórmula del medio y la función de cada uno Ingredientes función

---

---

---

---

---

---

---

1. ¿ Porque es importante el parámetro del pH para el crecimiento microbiano?

---

---

---

2. ¿Cómo se definen los medios de cultivos según su estado físico?

---

---

---

3. ¿ Cómo se definen los medios Según su uso?

---

---

Práctica # I. Título: ¨Toma de muestra y siembra primaria¨. a) Definición de muestra; clasificación. b) Técnicas para la toma de muestra. La siembra primaria y la resiembra. c) Distinguir la morfología de los diferentes grupos de M. O. II. Objetivo:

1. Conocer las diferentes muestras que se toman en el laboratorio clínico, así Como los procedimientos para ello. III. Desarrollo teórico Definición: Una muestra para el laboratorio de M.M. Es aquel fluido biológico que se recoge asépticamente con el objetivo de sembrarlo sobre un medio de cultivo. Los fluidos se clasifican en: I) Líquidos II) Emisiones I) Líquidos: Son fluidos que están presentes siempre en el organismo. Son estériles en condiciones normales, no presentan flora normal. Por ejemplo: ❖ Sangre ❖ Orina ❖ Semen ❖ LCR II) Emisiones: Están presente en algunos casos, pueden desaparecer y variar en cantidad y composición en el organismo. ❖ Expectoraciones (producto del TR). ❖ Defecación (producto del TG). ❖ Micción urinaria (producto de las vías urinarias, es la orina que atraviesa los conductos para salir al exterior). ❖ Secreciones y excreciones (todos los demás fluidos: faríngeo, vaginal, rectal óptico, nasal, ótico, etc.). III.a) Datos del paciente: De forma general antes de tomar la muestra se le debe preguntar al paciente: ❖ Si está tomando antibióticos. ❖ Fecha de inicio de los síntomas y evolución de los mismos (lo que se confirma con los datos del médico). ❖ La muestra debe ser debidamente identificada (nombre completo del paciente, edad, sexo, fecha y hora de muestreo, dirección y teléfono, nombre del médico, dirección o teléfonos).

III.b) Técnicas para la toma de muestra y la siembra primaria: Tipos de medios de cultivos más comunes para observar algunas bacterias:

• Para diferenciar las colonias de Estafilococos:
• Se utiliza un medio diferencial como el manitol
• Para diferenciar los Bacilos Gram negativos:
• Se utiliza un medio diferencial como el mcconkey.
• Para identificar las Mycobacterias :
• Se utiliza el medio selectivo de Lowestein Jensen.
• Para identificar los cocos gran positivos y los gran negativos.
• Se utiliza un medio de cultivo enriquecido como el agar sangre.
• Para identificar los hongos:
• Se utiliza un medio selectivo como el agar Sabureau
• Especies que componen la micro flora normal o Micro biota de la nasofaringe:
• Esta está constituida principalmente por :
• S. Aureaus.
• S. Pneumoniae.
• S.Viridans
• N. Species
• Para evitar que se coagule la sangre en el caldo de hemocultivo debe agregársele:
• polianetol sulfonato de sodio como anticoagulante, saponina como agente lítico de eritrocitos, leucocitos y macrófagos, polipropilenglicol como antiespumante y un fluoroquímico inerte de alta densidad. Existen diferentes áreas del cuerpo humano, para la toma de muestras y cada una tendrá diferentes técnicas para la siembra y diferentes medios de cultivos, esto de forma general se resumen en la tabla #1.
• Las siembras Esta pueden ser:
• Primarias
• La siembra primaria es la introducción (inoculación) del fluido biológico en el medio de cultivo, se puede realizar sobre medio solido (en placa), o en medios líquidos (en hemocultivos.Es la inoculación o colocación del material bacteriológico procedente de sus fuentes naturales.
• Secundaria.
• Estos se obtienen después de haber obtenido una siembra primaria y resembrándolo nuevamente en otro medio de cultivo.
• Tipos de siembras
• Siembra por extensión o embadurnamiento : Es una forma directa y fácil en ella se pasa un volumen pequeño de muestra microbiana al centro del agar y se extiende uniformemente sobre la superficie

• Cultivo primario:
• Estos resultan de la siembra del material bacteriológico procedente de sus fuentes naturales.
• Cultivos secundarios o sub-cultivos:
• Estos se obtienen después de haber obtenido un cultivo primario y resembrándolo nuevamente.
• Una colonia
• es una agrupación de microorganismos de una misma especie son macroscópicamente visibles en un medio sólido, semi-sólido y liquido cada colonia representa un cultivo puro.
• Para el estudio macroscópico de una colonia debemos tener en cuenta la siguientes características:
• Olor, tamaño, aspecto, consistencia, color, bordes, forma, altura, tipo de cultivo, cantidad de crecimiento del cultivo. Morfologías de las colonias ❖ Debemos recordar que la resiembra consiste en: ❖ Transferir la biomasa a medios de cultivos de diagnósticos y/o selectivo. ❖ En ellos se observaran cambios al final de la incubación que permitirán su identificación. Entre los medios de cultivo que se utilizan están los que evalúan ❖ capacidad de fermentar diferentes azucares. ❖ La capacidad de movimiento (por flagelación). ❖ La capacidad de crecer en medios con inhibidores. FORMA SUPERFICIE BORDE

❖ La capacidad para asimilar metabolitos específicos. Etc. La fermentación es el catabolismo que se caracteriza por tener como productos finales ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y a veces también gases (CO2, H2, NH3). Este test se puede desarrollar con el medio TSI (triple sugar iron) que es alcalino. Este test permitirá identificar géneros de entero bacterias. La movilidad : Las bacterias pueden ser móviles e inmóviles. El esclarecimiento de esta característica se realiza sembrándola en agar semisólido. Las bacterias móviles serán capaces de difundirse a través del agar semisólido al crecer y multiplicarse, mientras que las inmóviles solo crecen en la línea de inoculación. Entre los medios que permiten estudiar la movilidad está el SIM que quiere decir H2S, indol, movilidad. Este combina además la capacidad de detectar:

1. La producción de H2S (producirá H2S si el medio se ennegrece) y 2. Del Indol La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. (Será Indol positivo si al agregar el reactivo de Kovacs se torna rojo el medio y negativo si se queda igual). Este medio se utiliza para identificar géneros dentro de las Entero bacterias. Coloración y métodos en bacteriología Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio óptico, a menudo hay que fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad, acentuar las características morfológicas y conservarlos para estudios futuros - Frotis o extension: - Consiste en dispersar el material a observar al microscopio en una lámina portaobjeto, con la finalidad de conocer las características microscópicas de un microorganismo. Fijación: Este paso es previo a la coloración - Es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los microorganismos Existen dos clases : - Fijación con calor - en la que los bacteriólogos utilizan calor para fijar los frotis bacterianos. - Fijación química : - en la que se utilizan compuestos químicos como el ácido acético, cloruro mercúrico. el alcohol.

• Método de tinción diferencial : Este clasifica las bacterias en grupos diferentes a según sus propiedades de tinción. Su representante es la tinción de Gram. Desarrollada por el medico Danés Cristian Gram, en 1884, se trata de un método que divide las bacterias en Gram negativas y Gram positivas, este método es positivo, compuesto y diferencial. El paso más importante en la tinción de Gram como en todo proceso de tinción es la fijación de la muestra.
• Razónes sobre la diferencia que se observa en la respuesta a la tinción de Gram: a) Las bacterias Gram negativas
• son ricas en lípidos, por eso cuando se agrega durante el proceso el alcohol acetona los lípidos se disgregan, y así el colorante penetra a la célula bacteriana y esta se decolora. b) Las bacterias Gram positivas
• por el contrario son pobres en lípidos por eso no se decoloran permaneciendo con el primer colorante que se usó, estas bacterias son ricas en ácido teicoico. los protoplastos se obtienen a partir de las bacterias Gran Positivas.
• Diferencias entre una y otra:

1. Las paredes de las bacterias Gram. Positivas tiene: capas gruesas y homogéneas de Peptidoglucano y ácido teicoico
2. Las paredes de las bacterias Gram. Negativas tienen capa más fina rodeados de una membrana externa compleja de lipopolisacaridos

Tabla #1 Resumen sobre el manejo de las muestras Tipo de muestra Medios a usar Siembra Observaciones Atmosfera Tempe ratura Procedimiento Heces (copro cultivo) Diferencial para Entero bacteria Oxigeno 37º c ̊ Agotamiento Muestras en hisopos o en frascos estériles Orina (urocultivo) Enriquecido y diferencial Gram (-) Oxigeno 35º c Cuantitativa (asa calibrada) La muestra se recibe solo en frascos estériles Garganta Enriquecido Co2 35º c Agotamiento Muestras en hisopos Oído Esputo Nasal Ojos () Enriquecido Diferencial (staphylococc us) Diagnostico (bacilos Gram (-)) Hongos Co Oxigeno ¨ ¨ 35º c 35º c 35º c 25º c Agotamiento En el caso de los cultivos de esputo, observar que la muestra no sea saliva, de ser asi no se siembra, siendo necesario un segundo muestreo Vagina Y Uretra Enriquecido Co2 35º c 25º c Agotamiento Hacer preparación húmeda y sus extendidos Secreciones Y Excreciones () Co Oxigeno 35º c Agotamiento Hacer extendidos LCR () Co Oxigeno 35º c Enriquecimiento Hacer extendidos Sangre (hemocultivo ) () Co Oxigeno 35º c Agotamiento Incubar el frasco, hacer las siembras y resiembras, el cultivo sale a las 72 horas. Mycobacteria s Lowestein- Jensen Hacer digestión 35º c _ Incubar por 8 semanas y chequear todas las semanas para hacer extendido con su tinción Semen (*) Co Oxigeno 35º c Asa calibrada _ Anaerobio Enriquecido Anaerobio 35º c Agotamiento Jarra anaeróbica CUESTIONARIO:

1. Que es un cultivo primario? ___________________________________________________________________

---

---

2. Describa sobre el manejo de un urocultivo sembrado con asa calibrada.

---

---