¡Descarga laboratorio de biomol y más Resúmenes en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!
Lab de Biomol
Lab 1
Técnicas de Biología
M
Técnicas y aplicaciones
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se basa en la capacidad de la ADN polimerasa para sintetizar una nueva hebra de ADN complementaria a la cadena molde. Al final de la reacción de PCR, la secuencia especifica se acumulará en muchas copias llamadas amplicones. Esta técnica es simple y barata. Se utiliza para encontrar a los delincuentes, determinación de paternidad, COVID, etc.
Huella dactilar de ADN (ADN fingerprint)
Se crea un perfil de ADN del individuo escaneando 13 regiones de and o loci los cuales varían de persona en persona, los científicos encuentran los marcadores mediante diseño de sondas que son pequeñas piezas de ADN que se unen a la secuencia complementaria y una serie de sondas unidas a una muestra de ADN crean un patrón distintivo para un individuo.
Clonamientos
es la creación de un organismo que es una copia genética exacta del otro. Existen 3 diferentes tipos de clonación artificial Clonación de genes: produce copias de genes o segmentos de ADN Clonación reproductiva: produce copias de animales enteros Clonación terapéutica: produce células madre para de embriones para experimentos encaminados a la creación de tejidos para reemplazar tejido dañado o enfermo
ADN recombinante
Es un conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. Esta técnica se emplea para la producción de proteínas a gran escala y se logró por: el conocimiento de las enzimas de restricción, replicación y reparación de ADN, la replicación de virus y plásmidos y la síntesis química de secuencias d nucleótidos
Terapia génica
Utilizada en la corrección de genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades y se puede corregir de las siguientes formas: Un gen normal se puede insertar en una ubicación especifica dentro del genoma para reemplazar un gen no funcional Recombinación homologa Mutación inversa selectiva Se debe usar un vector para administrar el gen terapéutico a las células blanco del paciente.
Electroforesis
Separa fragmentos de ADN según su tamaño relativo.
Southern blot
Es una técnica utilizada para detectar una secuencia especifica de ADN en una muestra de sangre o tejido.
Northern Blot
Se utiliza para la detección de secuencias de ARN especificas desde una muestra de sangre o tejido. Una sonda es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para encontrar su secuencia complementaria de ARN que esta presente en la muestra así detectamos un gen.
Dot blot
Se detectan biomoléculas por cromatografía, esta técnica solo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula.
Hibridación in situs (HIS)
Consiste en marcar una hebra sencilla de ADN o ARN denominada sonada y luego permitir que se empareje con su secuencia complementaria y la sonda esta marcada de manera radioactiva.
Lab 2
Extracción de Ácidos
nucleicos
Independiente del tipo de muestra utilizada para la obtención de los ac nucleicos la técnica debe seguir los siguientes pasos: lisis de la célula, separación, purificación, precipitación, lavado y disolución. Uso de material estéril para impedir la degradación de nuestra muestra en el caso de ser RNA y debe realizarse en frio Lab 3 PCR y técnicas de hibridación
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Se considera una de las técnicas mas sensibles y especificas de las pruebas moleculares. La técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN genómico gADN o cADN, mediante ciclos que constan de 3 temperaturas, en cada ciclo las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan La longitud del producto la delimitan los iniciadores o primers de cuyo diseño depende el éxito de la PCR, estos deben ser específicos.
Componentes de la reacción de PCR.
Se requiere de una cadena de gADN o cADN que sirva de molde, una enzima ADN polimerasa y cofactores como el Mn o Mg, dNTP. Estos reactivos se mezclan y se someten en el termociclador a los ciclos de amplificación.
Esquema convencional de PCR
- Inicio de la desnaturalización: es necesaria una temperatura de 95ºC para la desnaturalización de la cadena de ADN, o el rompimiento de estructuras secundarias en el cADN y se debe mantener por 5 min 2. Ciclos de amplificación: un ciclo típico consta de 3 temperaturas, el cual se repite de forma continua por unos 30 a 35 veces 3. Desnaturalización: se realiza a 95ºC lo cual permite el acceso de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias y se mantiene por 30 s 4. Alineación: la temperatura se encuentra en un rango entre 55 y 65 º C así se genera la energía necesaria para que los iniciadores busquen en las cadenas de ADN su sec complementaria 5. Extensión: se produce a la temperatura optima para la polimerasa por lo que la temperatura dependerá de la enzima a utilizar 6. Ampliación final: se somete a un ciclo más de temperatura de extensión y se mantiene por unos 5 min 7. Almacenamiento temporal: se programa un ciclo a 4ºc por varias horas lo que permite conservar los productos
Fases de la PCR
Fase exponencial: en esta fase los reactivos se encuentran en concentraciones adecuadas, en este punto la reacción es precisa y especifica Fase lineal: la reacción en este punto es altamente variable Fase de saturación o plateau: es el punto de detección en gel para la PCR en punto final, la reacción se detiene y los productos de PCR no se sintetizan mas Técnicas de hibridación
Southern blot
Es una estrategia estándar para analizar el ADN previamente digerido con enzimas de restricción y se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos de ADN específicos
Son secuencias repetidas en tándem de entre 2 y 5 nucleótidos, característica que los diferencia de los VNTRs. Aplicaciones del DNA fingerprint Ciencia forense, comparando sospechosos con muestras de sangre, cabello, etc. Identificación de restos humanos Pruebas de paternidad Compatibilidad en donación de órganos Evolución población de animales salvajes Composición alimentos Hipótesis de migraciones humanas en la historia Lab 6 ADN recombinante Las moléculas de ADN recombinante son moléculas que tienen secuencias de ADN derivadas de más de una fuente, se considera una de las aplicaciones mas importantes: el aislamiento del genoma de un segmento particular de ADN que codifica in polipéptido determinado
Clonación de ADN
Es una técnica que produce grandes cantidades de un segmento de ADN especifico. El segmento que se clona se una primero a un ADN vector que es una especie de vehículo para transportar el DNA extraño a una célula, este vector contiene sex que le permiten replicarse dentro de la célula hospedadora Etapas:
- Obtención del fragmento de ADN de interés (gen)
- Unión a un vector: ADN recombinante
- Introducción a una célula hospedera
- Rastreo o screening: identificación de colonias que contienen el ADN recombinante de interés Herramientas básicas: Enzimas de restricción Vectores ADN ligasa Células hospederas
Estrategia general de clonación
Consta de los siguientes pasos: preparación del vector de clonación, preparación del inserto de ADN a clonar, ligación del ADN con el vector, transformación de bacterias y la identificación de las colonias que contienen el vector recombinante.
Purificación del inserto a clonar
Luego de la digestión enzimática con que es cortado el inserto del ADN de origen, el inserto se purifica del resto de la molécula ADN de donde proviene, mediante una electroforesis en gel
Vectores
Se define como una molécula de ADN de doble cadena dsADN, se clasifican en dos Vectores de clonación: su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del DNA insertado o de la molécula recombinante. Pueden ser plásmidos, bacteriografos, fagemidos, cosmidos, etc. Vectores de expresión: su objetivo es producir ARN o la proteína producto y pueden ser plásmidos o bacteriografos.
Componentes de los vectores de
clonación
Elementos básicos comunes: Origen de replicación: es una sec de ADN que reconoce a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación ORI Marcador de selección: es un gen que le confiere resistencia a un antibiótico Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de ADN que contine una serie de sitios únicos de reconocimientos para enzimas de restricción
Componentes de los vectores de
expresión
Poseen los elementos básicos en su estructura presente en los vectores de clonación, además de contar con un promotor fuerte. Se caracterizan por construir un sistema de inducción simple y efectivo. Debe incluir secuencias de terminación de la transcripción y de poliadelinacion para que el transcrito quede protegido de su degradación, otro factor importante es el sitio de unión al ribosoma que es la sec Shine-Dalgarno.
Transformación de bacterias
Transformación química Transformación por electroporación
Aplicaciones de la clonación molecular
Puede emplearse en la producción de proteínas eucariotas en bacterias, como hormonas, antibióticos, vacunas, generación de cultivos transgénicos, etc.
Clonación de DNA utilizando plásmidos
bacterianos
El ADN se extrae de células humanas, se fragmenta y luego se inserta en una población de plásmidos bacterianos
Producción de una genoteca de DNA
complementario
Las genotecas de DNA se construyen a partir de la secuencia de mRNA, de los cuales se sintetiza el ADNc por retrotrasncripcion, el ARNm remante es degradado. Los fragmentos de ADNc de doble cadena se clonan en el vector de elección
Formación de plantas transgénicas
utilizando plásmido Ti
El transgén se empalma en el ADN del plásmido Ti, se reintroduce en las bacterias huésped. Las bacterias que contienen al plásmido recombinante se utilizan para transformar las células vegetales y luego pa la tierra
