¡Descarga Inmovilización de Enzimas: Fundamentos, Métodos y Aplicaciones y más Diapositivas en PDF de Cinética Química y Catálisis solo en Docsity!
1
Inmovilización de enzimas.
Fundamentos, métodos y aplicaciones
Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications
D R. M IGUEL ARROYO
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid Tfno: 34-1-3944150 Fax: 34-1-3944672 e-mail: arroyo@solea.quim.ucm.es
RESUMEN La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la producción industrial de productos químicos, farmaceúticos, alimentos; en el tratamiento de residuos; en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas aplicaciones. En esta revisión se analizan los diferentes métodos de inmovilización de enzimas, y el efecto sobre las propiedades catalíticas y la estabilidad de los biocatalizadores obtenidos. Palabras clave: Inmovilización de enzimas. Estabilidad de enzimas.
ABSTRACT Immobilization of enzymes can dramatically improve their stability, and the biocatalysts available for the industrial production of chemicals, drugs and foods; waste treatment; clinical analyses and disease treatment and many other applications. In this review, different methods of immobilization of enzymes and the effect on catalytic properties and the stability of biocatalysts are considered. Key words: Enzyme immobilitation. Enzyme stability.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farma- céutica. Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
Presentan una gran actividad catalítica; Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar.
Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permi- tiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable.
II. ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y
2 MIGUEL ARROYO
que pueden ser reutilizadas repetidamente (1). Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (2).
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (3):
- El aumento de la estabilidad de la enzima;
- La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
- La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen en la Figura 1. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son (4):
- La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
- La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
- Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
- El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
FIGURA 1.- Reactores enzimáticos que emplean enzimas inmovilizadas.
En general, los métodos de inmovilización (5) se suelen clasificar en dos grandes categorías: 1) Retención física (Figura 2) y 2) Unión química (Figura 3).
1) Tanque agitado
2) Tanque agitado y alimentación continua
3) Lecho fluidizado y alimentación continua
5) Lecho empaquetado, en continuo y con reciclado
**4) Lecho empaquetado y alimentación continua
- Tanque agitado, alimentación continua y recuperación por ultrafiltración**
Producto
Sustrato
Producto
Sustrato
Producto
Sustrato
Sustrato
Producto Producto
Sustrato
4 MIGUEL ARROYO
UNION QUIMICA
Unión a Soportes
Reticulado Puro
Co-reticulado
membrana que formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos formas:
- mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana;
- por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.
IV. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA
IV.1. Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contamina- ciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
- Soportes inórganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
- Soportes órganicos. Se pueden clasificar en: Polímeros naturales : a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc). Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión covalente (Figura 3).
FIGURA 3.- Métodos de inmovilización mediante unión química.
Absorción Iónica
Unión Covalente
Reticulado
5 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS, MÉTODOS Y APLICACIONES
IV.1.1. Adsorción
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales f actores que influyen en la adsorción, son:
1. el pH del medio : controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido; 2. la fuerza iónica : al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína; 3. el diámetro de poro : debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima; 4. la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimática del derivado. Como principales ventajas de este método destacan:
- su preparación sencilla,
- su bajo coste,
- no hay cambios de especificidad enzimática,
- los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua. Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:
- la optimización de las variables que controlan la adsorción,
- los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecánico,
- la unión al soporte es débil. Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear resinas de intercambio iónico , las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
IV.1.2. Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas (Tabla 1). De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Este método presenta las siguientes ventajas:
- La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;
- La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;
- Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
- Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria. En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de inconvenientes:
- Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
- El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
7 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS, MÉTODOS Y APLICACIONES
IV.2. Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking , es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (7). El método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El co-reticulado , permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional. Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado a enzimas muy diferentes (8), las cuales se han utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos.
V. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN
A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema
8 MIGUEL ARROYO
heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno.
V.1. Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones (9):
- Una estabilización conformacional de la enzima de- bido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-sopor- te. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unión a soportes activados (Figura 4). La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima.
- Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.
- Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio.
- Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona que en el medio de reacción (10). En otros casos el soporte tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “acuofilia” del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima (11). Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación activa.
V.2. Efectos en la actividad enzimática
Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que:
- la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está impedido,
- los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima,
- la inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva,
FIGURA 4. La inmovilización estabiliza a la enzima.
10
- Efectos en el microentorno (15): La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente (v.g. CM-sephadex) tendrá en su microentorno una con- centración mayor de hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex).
VI. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización (Tabla 2) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.
Tabla 2. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización
METODO Inclusión en Atrapamiento Reticulado Adsorción Unión membranas química covalente
Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil Fuerza de unión Débil Media Débil-Media Media Fuerte Actividad enzimática Media-Alta Baja Baja Media Alta Regeneración soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil Coste proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta Validez General General Limitada General Limitada Resistencia microbiana Sí Sí Sí No No
En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones estable- cidas por el Working Party on Immobilized Biocatalysts (16):
MIGUEL ARROYO
11
Descripción 1. Esquema de reacción general 2. Enzimas a insolubilizar
- Tipo de soporte empleado
- Método de inmovilización
Preparación 1. Condiciones de reacción
- Rendimiento en peso seco
- Actividad residual del sobrenadante
CARACTERIZACIÓN DE
UN DERIVADO
INMOVILIZADO Caracterización 1. Configuración del biocatalizador fisico-química 2. Grado de hinchamiento
- Grado de compresibilidad en columna
- Abrasión en sistemas de agitación
- Velocidad mínima de fluidización
Cinética 1. Estabilidad de la enzima almacenada
- Estabilidad operacional
- Posibilidad de reutilización
- Grado de conversión
- Limitaciones difusionales
VII. APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS
Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:
- Aplicaciones analíticas: biosensores
- Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
- Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.
VII.1. Biosensores
Los biosensores se están convirtiendo en una herramien- ta imprescindible en medicina, en el control de calidad de los alimentos y en el control medioambiental. En principio, se puede diseñar un biosensor para cualquier tipo de compuesto que sea capaz de interaccionar específicamente con un sis- tema biológico. Generalmente, el biosensor (Figura 5) contie- ne una molécula biológica inmovilizada (enzimas, células, anticuerpos) próxima a un traductor que, en contacto con el analito, transformará la señal química producida en una señal eléctrica o de otro tipo (óptica, calorimétrica, acústica, etc.)(17). El empleo de los biosensores presenta las siguientes ventajas:
FIGURA 5. Componentes de un biosensor.
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS, MÉTODOS Y APLICACIONES
13
inmovilizadas de E. coli o Bacillus megaterium (Figura 6). Se calcula que la producción anual mundial de 6-APA mediante este método fue de 7500 toneladas en 1992 (21). La producción industrial de 7-ACA o 7-ADCA a partir de la cefalosporina C es más
compleja, aunque ya se han desarrollado procesos enzimáticos para su producción (22).
- Obtención de fármacos ópticamente puros La actividad biológica, la toxicidad, la distribución y el metabolismo de un fármaco dependen en gran medida de su estereoquímica (23). Hay muchos ejemplos que ilustran el diferente comportamiento farmacológico de los enantiómeros de una mezcla racémica. En algunos casos, un enantiómero presenta actividad mientras que el otro no tiene efecto farmacológico; uno es tóxico frente al otro que demuestra ser seguro y activo; e incluso hay casos en los que uno es agonista frente al otro que se comporta como antagonista (24). A pesar de todo, la mayoría de estos fármacos se han vendido como mezclas racémicas hasta hace poco al no existir una normativa clara al respecto, ni métodos económicos para realizar la separación de enantiómeros. La Industria Farmacéutica ha empezado a superar este último problema introduciendo métodos enzimáticos en la obtención de fármacos ópticamente puros (25). Un ejemplo es el empleo de lipasas microbianas inmovilizadas (26) en la obtención de antiinflamatorios no esteroídicos (Figura 7). El isómero S de estos ácidos (ibuprofeno, naproxeno o ketoprofeno) es el que posee actividad terapéutica, y también se ha obtenido con una gran pureza óptica empleando cristales reticulados de lipasa de Candida rugosa (CLEC-CR®^ ) (27). VII. 4. Aplicaciones en la Industria Alimentaria
FIGURA 6. Obtención de los precursores de antibióticos semisintéticos mediante enzimas inmovilizadas
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS, MÉTODOS Y APLICACIONES
14
FIGURA 7. Proceso biotecnológico de obtención de antiinflamatorios no esteroídicos ópticamente puros mediante el empleo de lipasas inmovilizadas.
Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparación y la conservación de los alimentos. Normalmente, las enzimas solubles añadidas son inactivadas por calentamiento una vez que el tratamiento ha concluido. En ocasiones se permite que continúe su actividad para que los alimentos desarrollen el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La inmovilización permite que las enzimas puedan ser reutilizadas repetidamente en operaciones continuas o discontinuas. De todas maneras, existen limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos económicos y sanitarios inherentes al procesado de alimentos (28). A continuación se resumen algunas de las aplicaciones conocidas de las enzimas inmovilizadas en la industria alimentaria:
1) En la hidrólisis de proteínas: Las enzimas proteolíticas se emplean en la modificación del contenido proteico de los alimentos. De esta forma se han conseguido hidrolizados de proteínas de trigo mediante el uso de pepsina y proteasa coinmovilizadas en chitosan (21). Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en la disminución del contenido de lactoglobulina en la leche (29), en la industria quesera y en la solubilización de concentrados proteínicos de pescado.
2) En la hidrólisis de hidratos de carbono: La presencia de lactosa en la leche (4,3-4,5%) y en algunos derivados lácteos es perjudicial para aquellas personas que carecen de lactasa intestinal, y su ingesta provoca diarreas y diversos trastornos intestinales. La eliminación de este azúcar se puede conseguir tratando la leche con ß-galactosidasa de levaduras inmovilizada en fibras de acetato de celulosa (30) y es de gran importancia en la preparación de productos lácteos dietéticos. Su eliminación también es interesante en la preparación de helados, ya que la lactosa tiende a cristalizar a temperaturas bajas. El proceso de degradación del almidón, procedente de diversas fuentes vegetales como el maíz, se realiza mediante la utilización de amilasa, glucoamilasa y glucoisomerasa inmovilizadas (31). De esta manera, se consigue un jarabe enriquecido en fructosa, que sirve de edulcorante en bebidas refrescantes como la Coca-Cola o Pepsi. La pectinasa se emplea para hidrolizar la pectina, componente estructural de frutas y verduras. Esto permite la obtención de un zumo menos viscoso y más concentrado. La pectinasa se emplea inmovilizada sobre diferentes soportes (PVC, poliéteres, poliacrilamidas, alúmina, etc.)(32).
3) En la mejora de las características organolépticas de ciertos alimentos (21). Así el empleo de células de Arthobacter globilis atrapadas en poliacrilamida permite eliminar el
MIGUEL ARROYO
16
(2) Taylor, R.F. (1991) Protein Immobilization: fundamentals and applications, Marcel Dekker, New York. (3) Hartmeier, W. (1985) Immobilized biocatalysts: from simple to complex systems. Trends Biotechnol. 3 : 149-153. (4) Martinek, K.; Mozhaev, V.V. (1987) Immobilization of enzymes: an approach to fundamental studies in biochemistry. Adv. Enzymol. 57: 179-249. (5) Kennedy, J.F.; Cabral, J.M.S. (1983) Solid Phase Biochemistry. Schouten, W.H. (ed.) Wiley Pub., New York. (6) Klei, H.E.; Sundstrom, D.W.; Shim, D. (1985) Immobilization of enzymes by microencapsulation en Immobilized cells and enzymes: a practical approach J. Woodward, ed. IRL Press, pág. 49-54. (7) Wong, S.S.; Wong, L.J.C. (1992) Chemical cross-linking for the stabilization of proteins and enzymes. Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874. (8) Margolin, A.L. (1996) Novel crystalline catalysts. Trends Biotechnol. 14: 223-230. (9) Klibanov, A.M_._ (1983) Immobilized enzymes and cells as practical catalysts. Science 219: 722-727. (10) Klibanov, A.M.; Kaplan, N.O.; Kamen, M.D. (1978) A rationale for stabilization of oxygen-labile enzymes: application to a clostridial hydrogenase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 3640-3643. (11) Reslow, M. Adlercreutz, P.; Mattiasson, B. (1988) On the importance of the support material for bioorganic synthesis. Influence of water partition between solvent, enzyme and solid support in water-proof reaction media. Eur. J. Biochem. 172: 573-578. (12) Goldstein, L. (1976) Kinetic behaviour of immobilized enzyme systems. Methods Enzymol. 44: 397-443. (13) Hornby, W.E.; Lilley, M.D.; Crook, E.M. (1968) Some changes in the reactivity of enzymes resulting from their chemical attachement to water-insoluble derivatives of cellulose. Biochem. J. 107 : 669-674. (14) Berezin, I.V.; Klibanov, A.M.; Martinek, K. (1975) Kinetic-thermodynamic aspects of catalysis by immobilized enzymes. Russ. Chem. Rev. 44: 17-47. (15) Katchalski, E.; Silman, I.; Goldman, R. (1971) Effect of the microenvironment on the mode of action of immobilized enzymes. Adv. Enzymol. 34: 445-536. (16) Working Party on Immobilized Biocatalysts (1983) Guidelines for the characterization of immobilized biocatalysts. Enzyme Microb. Technol. 5 : 304-307. (17) Griffiths, D.; Hall, G. (1993) Biosensors: what real progress is being made? Trends Biotechnol. 11: 122-130. (18) Scouten, W.H.; Luong, J.H.T.; Brown, R.S. (1995) Enzyme or protein immobilization techniques for applications in biosensor design. Trends Biotechnol. 13: 178-185. (19) Callegaro, L.; Denti, E. (1983) Applications of bioreactors in medicine. Int. J. Artif. Organs 6: 107-110. (20) Vlasov, L.G.; Tlstykh, P.I.; Ignatiuk, T.E. Razzakok, O.N. (1988) Preparation of lysozyme immobilized in textile carriers and its use in treating suppurative wounds. Antibiot. Khimioter. 33: 304-307. (21) Katchalski-Katzir, E. (1993) Immobilized enzymes: learning from past successes and failures. Trends Biotechnol. 11: 471-478. (22) Abbot, B.J. (1976) Preparation of pharmaceutical compounds by immobilized enzymes and cells. Adv. Appl. Microbiol. 20: 203-257. (23) Ariens, E.J. (1984) Stereochemistry, a basis for sophisticated nonsense in pharmacokinetics and clinical pharmacology. Eur. J. Clin. Pharmacol. 26: 663-668. (24) Ariens, E.J. (1989) Stereoselectivity in the action of drugs. Pharmacol. Toxicol. 37: 319-320. (25) Margolin, A.L. (1993) Enzymes in the synthesis of chiral drugs. Enzyme Microb. Technol. 15: 266-280. (26) Arroyo, M.; Sinisterra, J.V. (1994) High enantioselective esterification of 2-aryl propionic acids catalyzed by immobilized lipase from Candida antarctica : a mechanistic approach. J. Org. Chem. 59: 4410-4417. (27) Lalonde, J.J.; Govardhan, C.; Khalaf, N.; Martínez, A.G.; Visuri, K.; Margolin, A.L. (1995) Cross-linked crystals of Candida rugosa lipase: highly efficient catalysts for the resolution of chiral esters. J. Am. Chem. Soc. 117: 6845-
(28) Roland, J.F. (1980) Requirements unique to the food and beverage industry en Pitcher, W.H. et al. (eds.) Immobilized enzymes for food processing , CRC Press, Boca Raton, pp. 55-80. (29) Vuillemard, J.C.; Goulet, J.; Amiot, J.; Vijayalakshmi, M.A. (1988) Continuous production of small peptides from milk proteins by extracellular proteases of free and immobilized Serratia marcescens cells. Enzyme Microb. Technol. 10 : 2-8. (30) Honda, Y.; Kako, M.; Abiko, K.; Sogo, Y. (1993) Industrial Application of immobilized enzymes , Tanaka, A. et al. eds. Marcel Dekker, pág. 209-234. (31) Germain, P.; Crichton, R. (1988) Characterization of a chemically modified α-amilase immobilized on porous silica. J. Chem. Technol. Biotechnol. 41: 297-315. (32) Piffer, P.G.; Spagna, G.; Bustetto, L. (1987) Immobilization of endo-polygalacturonase on γ-alumina for the treatment of fruit juices. J. Mol. Catal. 42: 137-149. (33) Magee, E.L.; Olson, N.F.; Linslay, R.C. (1981) Microencapsulation of cheese ripening systems: production of diacetyl and acetoin in cheese by encapsulated bacterial cell free extract. J. Diary Sci. 64 : 616-621. (34) Posorke, L.H.; Lefebvre, G.K.; Miller, C.A.; Hansen, T.T.; Glenvig, B.L. (1988) Process considerations of continuous fat modification with an immobilized lipase. J. Am. Oil Chem. Soc. 65: 922-926. (35) Nagasawa, T.; Yamada, H. (1989) Microbial transformations of nitriles. Trends Biotechnol. 7: 153-158. (36) Mellor, R.B.; Ronnenberg, J.; Campbell, W.M.; Diekmann, S_._ (1992) Reduction of nitrate and nitrite in water by immobilized enzymes. Nature 355: 717-719. (37) Chibata, I.; Tosa, T. (1980) Immobilized microbial cells and their applications. Trends Biochem. Sci. 5: 88-90.
MIGUEL ARROYO
17 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS: FUNDAMENTOS, MÉTODOS Y APLICACIO- NES
