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Medicina Veterinaria y Zootecnia
Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Identificación de células leucocitarias en laboratorio de biología de la universidad de la amazonia Bolaños, C, Y^1 ; Tovar, A, L, D^1 ; Rosales P, P, M^1 ; Noreña, S, A, D^1
1. Estudiante de toxicología de quinto semestre de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de la Amazonia. Introducción La sangre es un tejido vital compuesto por diversos tipos de células suspendidas en el plasma. Entre sus componentes principales se encuentran los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, cada uno con funciones esenciales para el mantenimiento de la homeostasis (Rossini & García, 2010). Los eritrocitos, también conocidos como glóbulos rojos, son responsables del transporte de oxígeno y dióxido de carbono entre los pulmones y los tejidos, gracias a la presencia de hemoglobina. Por otro lado, los leucocitos, o glóbulos blancos, forman parte del sistema inmunológico y desempeñan un papel clave en la defensa del organismo contra agentes patógenos (Lílido, 2018). Se dividen en granulocitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y células mononucleares (linfocitos y monocitos), cada uno especializado en diferentes tipos de respuesta inmune. Finalmente, las plaquetas, fragmentos celulares derivados de los megacariocitos, son cruciales en el proceso de coagulación sanguínea, evitando la pérdida de sangre en caso de lesiones vasculares (Hudnall, 2023). El estudio morfológico de estos componentes se realiza comúnmente mediante frotis de sangre periférica, donde las células son teñidas utilizando colorantes específicos como la tinción de Wright-Giemsa, lo que permite su observación microscópica (Arias & Navarro, 2014). Este proceso es fundamental para identificar alteraciones hematológicas, tales como anemias, infecciones, y enfermedades autoinmunes. La identificación adecuada de leucocitos, eritrocitos y plaquetas es
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias esencial para el diagnóstico clínico, ya que cambios en su morfología y número pueden ser indicativos de patologías subyacentes (Keohane et al., 2015). En esta práctica de laboratorio se busca, mediante la observación microscópica, la identificación y clasificación de los diferentes tipos de células sanguíneas, así como la evaluación de sus características morfológicas. El conocimiento detallado de estas estructuras celulares es una herramienta fundamental en hematología, siendo clave en el diagnóstico de enfermedades como la leucemia, las infecciones bacterianas y los trastornos hemorrágicos (Gómez, 2013). Metodología Para llevar a cabo la práctica de frotis sanguíneo, la observación y la identificación de las células inmunitarias, como los leucocitos, se utilizaron los siguientes implementos: Tabla 1. Implementos utilizados en la observación y la identificación de las células inmunitarias IMPLEMENTOS UTILIZADOS EN EL LABORATORIO IMPLEMENTOS DE BIOSEGURIDAD Bata de laboratorio Guantes de nitrilo Tapabocas
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Microscopio Aceite de inmersión Marco teórico El frotis sanguíneo es una técnica básica y fundamental en hematología que consiste en la distribución de una gota de sangre sobre un portaobjetos, extendida en una capa delgada, para su posterior tinción y examen bajo el microscopio (Pérez-Écija et al., 2010). Esta técnica permite una visualización clara de los diferentes tipos celulares que circulan en la sangre periférica, proporcionando información clave sobre el estado de salud del paciente (Hernández, 2019). El frotis sanguíneo es esencial en la evaluación de las células sanguíneas, tanto por su cantidad como por su morfología. La identificación de alteraciones en el tamaño, forma y características internas de los eritrocitos, leucocitos y plaquetas es vital en el diagnóstico de enfermedades hematológicas y sistémicas (Pérez & Gómez, 2021). A través de él, se pueden identificar diversas alteraciones morfológicas y cuantitativas en las células sanguíneas, lo que facilita el diagnóstico de múltiples condiciones: El frotis permite clasificar diferentes tipos de anemia al observar características como la forma y el tamaño de los eritrocitos. Por ejemplo, en la anemia microcítica, los eritrocitos son más pequeños de lo normal, mientras que, en la anemia macrocítica, las células son anormalmente grandes (García, 2020). Mediante la observación de los leucocitos, es posible detectar infecciones bacterianas, virales o parasitarias. Además, la presencia de cambios reactivos en los
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias leucocitos puede indicar infecciones agudas o crónicas, identificando células anormales o inmaduras en la sangre periférica, que suelen estar presentes en enfermedades como las leucemias. Este examen facilita la identificación de células blásticas o leucocitos atípicos, que son características de estas patologías (Muñoz & Sánchez, 2020). En condiciones como la trombocitopenia (baja cantidad de plaquetas), el frotis sanguíneo permite observar la cantidad, tamaño y morfología de las plaquetas, ayudando a diagnosticar trastornos relacionados con la coagulación (Gallo-Lamping, 2014). Preparación del frotis sanguíneo La preparación del frotis sanguíneo es esencial para el diagnóstico hematológico, ya que permite una visualización clara de eritrocitos, leucocitos y plaquetas (Ortiz, 2019). El procedimiento consiste en obtener una gota de sangre, colocarla en un portaobjetos limpio, y extenderla con otro portaobjetos en un ángulo de 30-45 grados. El frotis debe secarse al aire libre y luego teñirse con colorantes como Wright o Giemsa para su observación al microscopio. Un frotis bien hecho tiene una distribución uniforme de células, lo que facilita la identificación de anomalías hematológicas (Silva, 2018). Principales defectos de una extensión sanguínea Según Gallo-Lamping, (2014) los principales defectos pueden ser:
- Extensión muy gruesa: Esto sucede cuando se coloca una cantidad excesiva de sangre en la muestra.
- Extensión demasiado delgada: Se produce cuando la cantidad de sangre es insuficiente o cuando la extensión se realiza muy lentamente.
- Bandas gruesas y delgadas alternadas: Ocurren debido a movimientos bruscos o irregulares durante el proceso de extensión.
- Rayas a lo largo de la preparación (especialmente en la cola): Estas pueden deberse a un borde del portaobjetos irregular, a que la sangre se secó en el borde o a la presencia de polvo.
- Manchas sin sangre en la muestra: Son causadas por la presencia de grasa en el portaobjetos.
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Imagen 1. Canino ENKI La docente inició la práctica brindando las indicaciones necesarias para realizar un frotis sanguíneo de manera correcta. Explicó detalladamente cada paso del procedimiento y realizó una demostración práctica sobre cómo preparar un frotis adecuado, destacando aspectos clave como el control del grosor de la muestra y la técnica de barrido para lograr una distribución uniforme de la sangre en el portaobjetos. Con la muestra de sangre ya disponible, se procedió a la preparación de los frotis sanguíneos. Para ello, se utilizó un microhematocrito para colocar una pequeña gota de sangre en un extremo del portaobjetos. A continuación, se empleó otro portaobjetos en un ángulo de 45° para realizar el barrido de la muestra. Este movimiento controlado permitió obtener una capa delgada y homogénea de sangre, con Cola ola Cuerpo o la Cabeza o la Imagen 2. Canino ENKI
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias tres áreas características: cabeza, cuerpo y cola. Estas zonas son fundamentales para la correcta observación microscópica, ya que permiten identificar las células sanguíneas de manera adecuada (Sánchez, 2020). Después de varios intentos iniciales, en los que no se logró el grosor adecuado del frotis, finalmente se obtuvieron dos frotis de calidad aceptable para el análisis. Una vez preparados los frotis, se dejaron secar al aire durante unos minutos. Imagen 6. Frotis Sanguíneos Posteriormente, se procedió a la tinción de las muestras utilizando la tinción de Wright-Giemsa. La técnica de tinción de Wright, que resulta en una coloración de tono violeta. Esta técnica se basa en la combinación de dos tipos de colorantes: los colorantes básicos, como el azul de metileno, que se unen a las estructuras celulares y las tiñen de azul, y los colorantes ácidos, como la eosina, que aportan un color rojo a las zonas que tienen mayor afinidad por estos compuestos (Ramírez & Lozano, 2020). La mezcla se dejó actuar durante un tiempo específico de 5 minutos, permitiendo que Imagen 4. Gota de sangre con microhematocrito. Imagen 3. Llenado del microhematocrito con sangre Imagen 5. Portaobjetos en un ángulo de 45°
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias La aplicación del Buffer se realizó sobre la tinción previa y se dejó actuar durante 1 minutos. Una vez transcurrido este tiempo, las láminas se enjuagaron cuidadosamente con abundante agua para eliminar cualquier residuo de colorante. Posteriormente, se colocaron sobre servilletas para secar, asegurando así que estuvieran listas para su análisis en el microscopio, donde se examinaron las características de los leucocitos, eritrocitos y plaquetas presentes en la muestra. Imagen 9. Lamina con tinción Después de permitir que las láminas teñidas se secaran por completo, fueron llevadas al microscopio para realizar las observaciones necesarias. Se aplicó una gota de aceite de inmersión para optimizar la visualización del frotis en el objetivo de 100x, lo que es fundamental para obtener imágenes más nítidas y detalladas. Se visualiza en la parte final del frotis llamada cola, donde la capa de sangre es más delgada y está libre de residuos de colorante, permitiendo que las células se presenten bien teñidas y diferenciadas. Esta técnica no solo mejora la claridad de las imágenes, sino que también facilita la identificación de las distintas morfologías celulares, lo que permite un análisis más preciso. En esta práctica se examinaron dos frotis sanguíneos. El primero fue proporcionado por la docente para visualizar las células leucocitarias de un canino, mientras que el segundo fue el frotis realizado por los estudiantes durante la clase. El propósito principal de la observación era identificar los diferentes tipos de células presentes en la muestra, como leucocitos, eritrocitos y plaquetas, lo cual es fundamental para evaluar el estado de salud del animal y detectar posibles anomalías.
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Resultados Tabla 2. Laminilla 1 Frotis sanguíneo de un canino facilitado por la docente IMAGEN DESCRIPCIÓN Campo 1: Identificación microscópica utilizando el objetivo de 100x usando aceite de inmersión: se observó un monocito (A). Campo 2: Identificación microscópica utilizando el objetivo de 100x usando aceite de inmersión: se observó un neutrófilo (A).
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Giemsa facilita la identificación de estos gránulos gracias a su afinidad por colorantes ácidos que contienen proteínas como la peroxidasa y proteínas catiónicas (Rothenberg & Hogan, 2006). El papel de los eosinófilos en cantidades normales es fundamental para mantener un adecuado equilibrio inmunológico, ya que intervienen en la defensa contra parásitos y en reacciones alérgicas mediante la liberación de gránulos que contienen enzimas con la capacidad de eliminar patógenos o regular la inflamación (Rosenberg et al., 2013) Sin embargo, en ciertas condiciones patológicas se observa un aumento en la cantidad de eosinófilos en la sangre, un fenómeno conocido como eosinofilia, que puede estar asociado a infecciones parasitarias, reacciones alérgicas, enfermedades autoinmunes o ciertos tipos de cáncer (Tizard, 2018). Durante el análisis microscópico del frotis sanguíneo, se observaron gránulos libres, lo cual indica que los eosinófilos han sufrido un proceso de activación y desgranulación. Este proceso ocurre cuando los eosinófilos son estimulados por citocinas o complejos inmunes en el contexto de respuestas inflamatorias o alérgicas, liberando así el contenido de sus gránulos en el espacio extracelular para combatir patógenos (Acharya & Ackerman, 2014) La liberación de gránulos es una estrategia defensiva que permite a los eosinófilos enfrentarse a infecciones, aunque también puede contribuir al desarrollo de enfermedades inflamatorias si este proceso ocurre de manera excesiva o inapropiada es importante, distinguir si la aparición de gránulos libres se debe a la activación celular genuina o a un artefacto generado durante la preparación del frotis (Tizard, 2018). Además, la presencia de esto gránulos libres en el frotis sanguíneo, se puede ocacionar debido a una manipulación inadecuada durante la preparación de la muestra. Durante el proceso de extensión del frotis, si se ejerce demasiada presión o se realiza de forma brusca, los eosinófilos pueden dañarse y liberar sus gránulos al entorno circundante. Esto también puede ocurrir si la muestra de sangre es antigua o si
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias se ha producido un secado excesivo antes de la fijación y tinción, lo que fragiliza las células y facilita la liberación de los gránulos (Brooks et al., 2 022 ) Neutrófilos Los neutrófilos son las células inmunitarias más abundantes en la circulación sistémica, representando aproximadamente entre el 60% y el 70% del total de leucocitos en sangre (Brostoff et al., 2007). Durante el análisis microscópico, se corroboró esta predominancia, ya que se observaron neutrófilos en 5 de los 7 campos evaluados como se evidencia en la Tabla 2, estas células se distinguen fácilmente por su núcleo multilobulado, citoplasma granular, circular, diámetro de 12.0μ a 15.0μ presentan un citoplasma granular de color rosa pálido; con cromatina densa y una tinción intensa como se presentan en la tabla 2, En la figura # se pueden observar neutrófilos circulantes normales, obtenidos de la web, que presentan características similares a las muestras analizadas durante la práctica, esta coincidencia en la morfología sugiere que las muestras recolectadas son representativas de la población celular esperada en condiciones fisiológicas, lo que respalda la validez del análisis realizado. (Rebar, 2003). Imagen 10. Figura Neutrófilos Circulantes normales tomado de (Rebar, 2003) Desempeñan un papel crucial en la respuesta inmune innata, participando activamente en la fagocitosis y neutralización de patógenos, son los primeros en responder ante infecciones microbianas y parasitarias, actuando principalmente a través de la fagocitosis (Welsch, 2009). A diferencia de los macrófagos, que continúan
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias macrófagos, facilitando su migración a los tejidos y su posterior diferenciación (Rebar,
Imagen 11. Monocitos caninos normales tomado de (Rebar, 2003) Conclusión Durante la práctica de laboratorio, se realizó con éxito la elaboración de un frotis sanguíneo, siguiendo los pasos adecuados para su respectiva preparación, tinción y observación. A través del microscopio, mediante el objetivo de 100x, fue posible identificar y diferenciar las principales células sanguíneas leucocitarias, entre los cuales se observaron con mayor frecuencia neutrófilos, logramos observar también monocitos y neutrófilos reflejando la distribución habitual en un frotis normal. Un hallazgo particular fue la observación de un eosinófilo lisado, donde sus gránulos se encontraban dispersos fuera de la célula, probablemente debido a un daño mecánico durante la preparación del extendido. Esto resalta la importancia de una técnica cuidadosa al realizar frotis para evitar la lisis celular. Además, se identificaron claramente las diferencias morfológicas entre los tipos celulares, lo que permitió desarrollar el análisis de cada uno de ellos, tanto en su forma como en sus características distintivas.
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias En general, la práctica permitió reforzar los conocimientos sobre la identificación y clasificación de las células sanguíneas en este caso la leucocitarias, así como la importancia de la correcta manipulación y observación de las muestras para evitar artefactos que pudieran interferir con los resultados.
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Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Medicina Veterinaria Y Zootecnia - V Semestre - Inmunología Universidad De La Amazonia Facultad De Ciencias Agropecuarias Gómez, A. R. M. (2013). Atlas de morfología celular, alteraciones y enfermedades relacionadas. Pontificia Universidad Javeriana. Hernández, J. (2019). Manual de Hematología. Editorial Universitaria. Editorial Universitaria. Hudnall, S. D. (2023). Hematology: A pathophysiologic approach. Elsevier Health Sciences. Keohane, E. M., Walenga, J. M., & Smith, L. (2015). Rodak’s hematology: clinical principles and applications. Elsevier Health Sciences. Lílido, R. (2018). LOS LEUCOCITOS EN MAMIFEROS DOMESTICOS. Mundo Pecuario , 2 (2), 37–39. Muñoz, V., & Sánchez, L. (2020). Plaquetas: Trastornos y su diagnóstico por frotis. Hematología Clínica , 92–104. Ortiz, C. (2019). Aplicaciones clínicas del frotis sanguíneo en medicina veterinaria. Veterinaria y Salud Animal , 40 (5), 63– 71 Osorio, J. H. (2010). Efecto del tipo de anticoagulante utilizado en la toma de muestras, sobre la determinacion del perfil de acilcarnitinas en sangre y plasma. Biosalud , 9 (2), 9–13. Pérez, M., & Gómez, A. (2021). La importancia del frotis sanguíneo en el diagnóstico hematológico. Revista de Ciencias Médicas , 35 (2), 45. Pérez-Écija, R. A., Estepa, J. C., & Mendoza, F. J. (2010). Análisis y estudio del frotis sanguíneo. Argos: Informativo Veterinario , 115 , 60–63. Ramírez, L. C. C., & Lozano, L. C. (2020). Principios físicoquímicos de los colorantes utilizados en microbiología. Nova, 18(33), 73-100. NOVA , 18 (33), 73–100. Rossini, M., & García, G. C. (2010). Descripción morfológica de las células sanguíneas de la Baba. Revista de La Facultad de Ciencias Veterinarias , 51 (2), 063–070. Sánchez, L. (2020). Guía práctica de hematología. Editorial Biomédica. Silva, F. (2018). Parasitología y su relación con el frotis sanguíneo. Journal of Infectious Diseases , 22 (3), 78–85.
