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GUÍA DE PROCEDIMIENTO: FRAGILIDAD CROMOSÓMICA
EN FIBROBLASTOS
UNIDAD DE SOPORTE AL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO
SUBUNIDAD DE SOPORTE AL DIAGNÓSTICO
SERVICIO DE GENÉTICA
Elaborado por:
Sub Unidad de Soporte al Diagnostico
Equipo Técnico del Servicio de Genética
Revisado por:
Unidad de Soporte al Diagnóstico y Tratamiento Sub Unidad de Soporte al Diagnóstico Unidad de Gestión de la Calidad
Aprobado por:
Dr. Antonio Ricardo Zopfi Rubio Director del Instituto Nacional de Salud del Niño - San Borja
Fecha: Abril 2019 Código: GP-005/USDT-SG/INSN-
GUÍA DE PROCEDIMIENTO: FRAGILIDAD CROMOSÓMICA EN
- Página 2 de
- I. Título....................................................................................................................................................................... FIBROBLASTOS
- II. Finalidad
- III. Objetivos
- a. Objetivos Generales
- b. Objetivos Específicos
- IV. Ámbito de aplicación.......................................................................................................................................
- V. Nombre del Proceso o Procedimiento a Estandarizar y Código CPT.......................................
- VI. Consideraciones Generales
- a. Definiciones Operativas.................................................................................................................................
- Definición del Procedimiento
- Aspectos Epidemiológicos importantes
- Consentimiento Informado
- b. Conceptos Básicos
- c. Requerimientos Básicos
- VII. Consideraciones Específicas......................................................................................................................
- a. Descripción detallada del Proceso o Procedimiento: ....................................................................
- b. Indicaciones.......................................................................................................................................................
- Indicaciones Absolutas ...........................................................................................................................
- Indicaciones Relativas .............................................................................................................................
- c. Riesgos o Complicaciones Frecuentes:.................................................................................................
- d. Riesgos o Complicaciones poco Frecuentes: .....................................................................................
- e. Contraindicaciones ........................................................................................................................................
- VIII. Recomendaciones ...........................................................................................................................................
- IX. Autores, Fecha y Lugar .................................................................................................................................
- X. Anexos ..................................................................................................................................................................
- XI. Bibliografía ........................................................................................................................................................
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VI. Consideraciones Generales
El estudio de fragilidad cromosómica es una prueba para la evaluación de la inestabilidad cromosómica. El síndrome más común diagnosticado mediante esta prueba, es la Anemia de Fanconi (FA). FA se caracteriza por insuficiencia medular a temprana edad, el aumento del riesgo de cáncer y anormalidades físicas. Los individuos con FA son clínicamente heterogéneos y hasta un 25% de los pacientes con FA conocido presentan pocas o ninguna de las características. Los individuos con índice de fragilidad cromosómica (IFC) en sangre periférica en el rango de 40-53 serán considerados como mosaicos para Anemia de Fanconi, estos pacientes serán candidatos para descartar esta condición mediante el estudio de fragilidad cromosómica en fibroblastos.
a. Definiciones Operativas
1. Definición del Procedimiento
El procedimiento aplica a todo el personal especializado o capacitado en citogenética en enfermedades genéticas constitucionales y hemato-oncológicas. La presente guía se aplicará a pacientes de edad pediátrica con sospecha de Anemia de Fanconi de tipo mosaico en el Instituto Nacional del Niño de San Borja. En población pediátrica se sugiere tomar la biopsia de piel (punch) a la altura del cuadrante superior externo del glúteo, obteniendo un aproximado de 0.2cm^3 de muestra. La muestra deberá ser conservada en medio de transporte en un tubo cónico de 15ml con tapa rosca y sellada con parafilm. Deberá ser transportada inmediatamente a temperatura ambiente y entregada el mismo día de su toma Comprende las etapas de: toma/recepción de la muestra, iniciación del cultivo, cosecha del cultivo, preparación de láminas, coloración de las láminas (Giemsa), análisis citogenético, informe final y validación del informe final. Se asegurará que los equipos e instrumentos funcionen correctamente, y los reactivos se encuentren estériles y dentro de la fecha de vigencia. Las normas de bioseguridad se aplicarán durante todo el proceso.
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2. Aspectos Epidemiológicos importantes
La Anemia de Fanconi (AF) es el grupo más frecuente de anemia aplásica en la infancia. Afecta aproximadamente a 1:360.000 nacidos vivos. Se considera heterocigota al 0,5% de la población, aunque hay variabilidad étnica. La frecuencia de heterocigotos en EE.UU. y en Europa es 1/300, en Sudáfrica y entre los judíos ashkenazis aumenta a 1/100. Se reporta mosaicismo somático entre el 15-25%.^1 La proporción de varones y mujeres es de 3:1. La edad media al diagnóstico es de 8 años. El 75 % de los casos se diagnostica entre los 4 y 14 años aunque hay casos reportados desde el nacimiento hasta los 48 años.^2 Debido al solapamiento fenotípico de la AF con la asociación VACTERL, es necesario considerarlo dentro de los diagnósticos diferenciales. Su prevalencia exacta y los datos de incidencia no están disponibles debido a los criterios de diagnóstico variables, pero se ha informado que la asociación se produce en <1-9/100.000 niños, y la incidencia anual es de 1/10.000 a 1/40.000 nacidos vivos. No se ha encontrado una distribución geográfica específica o un predominio en ciertos grupos étnicos.
3. Consentimiento Informado
Todo paciente que sea sometido al Procedimiento de Fragilidad Cromosómica en Fibroblastos debe tener un consentimiento informado. El consentimiento informado debe ser firmado por el tutor legal del paciente previo a la realización del procedimiento. El médico tratante, debe informar y explicar en términos sencillos en que consiste la patología del paciente, el procedimiento, los objetivos, así como los riesgos y beneficios de este. El tutor legal debe registrar su aprobación o negación, cumpliendo las normas vigentes, en el formato de Consentimiento Informado (Ver Anexo 1). Se exceptúa de este procedimiento en caso de pacientes en situación de emergencia, conforme a Ley.
b. Conceptos Básicos
ABERRACIONES CROMATÍDICAS (cht):^3
Son aquellas aberraciones que involucran a una sola cromátide en un cromosoma. Se pueden distinguir los siguientes tipos de aberraciones:
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ANALISIS CITOGENÉTICO: 4,
En el Análisis de fragilidad cromosómica se evalúan las aberraciones cromatídicas y cromosómicas y los puntajes se otorgan como:
Único evento: a las ruptura cromatídica y cromosómica Dos eventos: a las Configuraciones de intercambio de cromátidas: triradiales Tres eventos: cuatriradiales, dicéntricos, anillos y translocaciones Más de ocho eventos: figuras de intercambio complejas y dependiendo del número de centrómeros y rupturas No se considera como eventos a las brechas cromatídicas, cromosómicas y cromosomas pulverizados
Se utilizará la siguiente terminología:
Células Aberrantes (CA): Células con un único evento Células Multiaberrantes (CMA): Células con dos o más eventos Número de eventos de Células Multiaberrantes (NCMA): Número total de eventos de células con dos o más eventos Frecuencia de aberraciones(FA): Número total de eventos de células analizadas, que es igual a la sumatoria de células aberrantes (CA) y número de eventos de células multiaberrantes (NCMA) Índice de Fragilidad Cromosómica o “Chromosome Fragility Index” (IFC): se calcula tomando en cuenta el porcentaje en número de eventos en cultivos con DEB de 1.5ul y de 2.5ul
Los índices calculados más usados y que se utilizan para el análisis son:
Índice de Fragilidad Cromosómica o “ Chromosome Fragility Index ” (IFC) Porcentaje total de células radiales igual o mayor a 10 eventos resultado de la suma de celulas aberrantes y multiaberrantes en 50 metafases analizadas
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c. Requerimientos Básicos
El procedimiento de Fragilidad Cromosómica en Fibroblastos, se llevará a cabo en el Área de Citogenética del Servicio de Genética de la Unidad de Soporte al Diagnóstico y Tratamiento del Instituto Nacional del Niño de San Borja.
1. TOMA/RECEPCIÓN DE MUESTRA
1.1 MATERIAL MÉDICO NO FUNGIBLE
Bisturí Pinzas estéril (2) Plumón de Tinta Indeleble Punta Fina Gradilla de polipropileno para tubos de 5ml y15ml
1.2 MATERIAL MÉDICO FUNGIBLE Algodón Hidrófilo Esparadrapo Antialérgico de Papel Tubo cónico para centrifuga de 15 ml. Jeringas de 1 ml, 3 ml o 5 ml Biopunch (dispositivo descartable para biopsia cutánea) Sterilstrip Gasa Papel parafilm Guantes descartables Gorras quirúrgicas Mascarillas Papel Toalla Gasa. Recipiente de material punzocortante
1.3 REACTIVOS
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Plumones indelebles. Lápiz marcador de cera. Lapiceros. Ficha de registro para indicación y característica de la muestra. Cuaderno de registro de las muestras.
2.3 MATERIAL MÉDICO FUNGIBLE
Frascos de cultivo celular de poliestireno graduado 25cm2 cuello inclinado con tapa con filtro (T25). Tips para micropipeta descartables 10ul-100ul y 0.5-10ul Filtros estériles para jeringa Jeringa de 1ml,3ml,5ml,20ml y 50ml Filtros para preparación de medios por bomba al vacío y/o decantación por gravedad Crioviales de 2ml y 5ml Tubos cónicos de polipropileno para centrifuga de 15ml Pipetas descartables de 3ml Pipetas descartables de 10ml (para pipeteador automático) Placa Petri estéril de 100x20mm Placa petri estéril de 35x10mm Hojas de bisturí estériles Papel parafilm Guantes de nitrilo descartables Gorras quirúrgicas Mascarillas Papel Toalla Recipiente de material punzocortante Masking tape Gasa
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2.4 REACTIVOS
Medio de cultivo para fibroblasto o medio completo para cultivos a largo plazo Glutamina Medio de transporte (RPMI Preparado) Hanks solución balanceada o DPBS ( libre de Ca y Mg ) Diepóxido 1-3 Butadieno (DEB) solución stock Solución de antibiótico – antimicótico para cultivo. Solución de trabajo con colagenasa tipo I Tripsina EDTA (Solución 0.25%) Suero bobino fetal (activar) Solución NaCl 0.9%.
3. EQUIPAMIENTO Y SUPLEMENTOS DE LA ETAPA DE COSECHA
3.1 EQUIPOS BIOMÉDICOS
Cabina biológica de seguridad de flujo vertical tipo II Cabina de extracción de vapores Balanza analítica electrónica Incubadora de 37°C con %5 de CO^2 Baño de Calentamiento (Baño María) Centrífuga Pipeta automática con cargador Microscopio invertido con objetivo de 10X, 20X Refrigerador de 4°C Congelador -20°C.
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Recipiente de material punzocortante Contenedor de bioseguridad para líquidos de desecho Masking tape Plumones indelebles Marcador de cera Lápiz Marcador punta diamante
3.4 REACTIVOS
Hanks solución balanceada o DPBS (libre de Ca y Mg) Medio completo para cultivo (con suero bovino fetal) Solución de Tripsina- EDTA 0.25% Solución Hipotónica -KCl Ácido acético glacial Metanol Colcemid: Solución de 10 μg/ml Etanol 96%
4. EQUIPAMIENTO DE LA ETAPA DE PREPARACIÓN, COLORACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS LÁMINAS
4.1 EQUIPOS BIOMÉDICOS
Cabina biológica de seguridad de flujo vertical tipo II Cabina de extracción de vapores Balanza analítica electrónica Estufa Secadora eléctrica Agitador magnético Microscopio compuesto con tubo trinocular
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Cámara trinocular Estación de Citogenética/Cariotipador Computadora Potenciómetro (pH) Impresora
4.2 MATERIAL MÉDICO NO FUNGIBLE
Micro pipetas 10-100 μl Coplin de vidrio para tinción Rack para tubos de 15 ml Canastilla de vidrio para coloración de 25 láminas Cubeta de acero inoxidable con asa para coloración de láminas Probetas graduadas de 250, 500 y 100 ml Pinza de acero inoxidable Embudo Bagueta Frasco para laboratorio con vidrio color ámbar de 250 y 500ml Frascos para laboratorio con tapa rosca de 500 y 1000ml Beaker de 250 ml y 500ml Cajas Porta láminas x Pizeta
4.3 MATERIAL MÉDICO FUNGIBLE
Tips estériles para micro pipeta 1-300ul Papel aluminio Láminas portaobjeto Pipetas descartables de 3 ml
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En población pediátrica se sugiere tomar la biopsia de piel (punch) a la altura del cuadrante superior externo del glúteo, obteniendo un aproximado de 0.2cm^3 de muestra La muestra deberá ser conservada en medio de transporte (medio de cultivo o suero fisiológico, más antibiótico), preferente en un tubo cónico de 15ml con tapa rosca y sellada con parafilm Recepción de muestra debidamente rotulada sin señal de contaminación o turbidez Deberá ser transportada inmediatamente a temperatura ambiente y entregada el mismo día de su toma
7.1.2 Verificar si la orden de fragilidad cromosómica en fibroblastos registra los siguientes datos:
Determinar tipo de muestra: Onco- hematológica o Constitucional Nombres y apellidos del paciente. (número de contacto) Fecha y Hora de recepción Número de registro Diagnóstico presuntivo Tratamiento recibido: antibióticos, corticoides, quimioterápicos, etc. Antecedentes Nombre del médico tratante/solicitante. (número de contacto)
Nota: No se procesara la muestra y se solicitará una nueva muestra, si la
muestra presentara: Signos de contaminación, muestra sin rotular y/o
medio de transporte sin identificación.
7.2 ETAPA DE INICIACIÓN DEL CULTIVO O SIEMBRA:5,
7.2.1 Preparación de Diepoxibutano (DEB): (Ver anexo N°2) 7.2.2 Antes de iniciar el proceso, encender el UV por 15 minutos en la cabina de extracción 7.2.3 Luego encender el ventilador por 3 minutos y desinfectar la cabina con alcohol al 70%
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7.2.4 El personal deberá colocarse: mandil, gorra quirúrgica, mascarilla y guantes quirúrgicos 7.2.5 Rotular tres frascos T25, el código de la muestra e indicar el tiempo y las características del cultivo, se utilizarán las siguientes abreviaturas Abreviaturas Tiempo de Cultivo Cód. del paciente DEB Fibroblasto CON- A Cód. del paciente DEB Fibroblasto CON- B Cód. del paciente Control 7.2.6 Retirar muestra del tubo de transporte y colocarla en una placa Petri (35x10mm.). Especificar apariencia, color, textura, medio de transporte y espécimen recibido en la hoja formato en registro para cultivo de tejidos 7.2.7 Lavar repetidamente con solución Hanks o suero fisiológico utilizando una pipeta de 3ml hasta limpiar bien la muestra 7.2.8 Una vez lavada, colocar la muestra en una placa Petri de 100x20mm(Petri A) 7.2.9 Usando una pinza quirúrgica y un escalpelo #21 cortar la muestra en tres partes iguales 7.2.10 Colocar un tercio con 1ml de medio de cultivo completo (Petri A), otro tercio en una nueva placa Petri de 100x20mm con 1ml de medio de cultivo completo (Petri B) y el último tercio en una nueva placa Petri de 100x20 con 1ml de medio de cultivo completo (Petri C o Control) 7.2.11 Muestra en Petri A será tratada con colagenasa , Petri B y C serán procesados como explante
Disociación por colagenasa (Petri A)
Preparación de colagenasa Disolver 250mg en 16mlde medio RPMI o MEM Filtrar la solución usando filtro para jeringa de 0.22um Alícuotas de solución en crio viales de 2ml y almacenar a -20C
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7.2.25 Hacer una etiqueta con el nombre de la muestra, código y fecha. Pegar la etiqueta en la incubadora y registrar en el cuaderno de cultivos
Explante Control (Petri C) 7.2.26 Utilizando escalpelos, fragmentar mecánicamente la muestra en la placa Petri C 7.2.27 Usando una pipeta de 3ml añadir 1ml de medio de cultivo completo a la muestra fragmentada y homogeneizar 7.2.28 Con la misma pipeta de transferencia distribuir de manera uniforme la muestra re suspendida en volúmenes de 0.5ml al frasco T25 con filtro, previamente rotulado con el código o nombre del paciente, así como con la letra C 7.2.29 Hacer una etiqueta con nombre de la muestra, código y fecha. Pegar la etiqueta en la incubadora y registrar en cuaderno de cultivos
Control de crecimiento y mantenimiento de cultivo (Para frascos de cultivo A B y C) 7.2.30 Pasadas 24 o 48 horas, evaluar adhesión celular bajo el microscopio invertido 7.2.31 Si existe adhesión, continuar. De no ser así, dejar incubar un día más hasta presentar adhesión celular 7.2.32 Agregar 3 ml de medio completo para fibroblastos al frasco T25 llegando a un volumen total de 5ml e incubar por 48 horas 7.2.33 Evaluar crecimiento celular y hacer recambio de medio de cultivo (5ml por frasco T25). Incubar por 48 horas (x2) 7.2.34 48 horas previo a la cosecha, observándose una confluencia de aproximadamente un 50%, se procederá a retirar los cultivos rotulados con DEB de la incubadora y se adicionará la solución DEB de trabajo (solución de trabajo B)en distintas concentraciones a cultivos rotulados con FIBROBLASTO DEB [CONC- A] y el otro cultivo con FIBROBLASTO DEB [CONC- B]. Al cultivo (C) no se le agregara DEB y será utilizado como control de daño espontáneo en el paciente
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7.2.35 Homogeneizar los frascos de cultivo y nuevamente colocarlos en posición horizontal en la incubadora de CO2 a 37 °C por 48 horas adicionales hasta llegar a un tiempo de cosecha 7.2.36 Determinar confluencia de 70%-80%, determinar presencia de células de aspecto refulgente y proceder a cosecha
7.3 ETAPA DE COSECHA5,
Preparación del Fijador (Carnoy): mezclando en una proporción de 3 a 1 de metanol y el ácido acético Encender el UV por 15 minutos en la cabina de flujo laminar Luego encender el ventilador por 5 a 10 minutos El personal deberá colocarse: mandil, gorra quirúrgica, mascarilla y guantes quirúrgicos Retirar el colcemid (solución en PBS o HBSS) del refrigerador para llevarlo a temperatura ambiente Agregar 100ul colcemid (concentración de 0.1ug/ml) por frascos de cultivo T25 y homogeneizar. Llevar el frasco a la incubadora de CO2 a 37 °C por una hora y media Pasado tiempo de exposición a colcemid, descartar el medio Añadir 2ml de solución balanceada Hanks o DPBS para lavar el frasco T25. Lavar y descartar. Repetir procedimiento una vez más Añadir 1-2 ml de solución de tripsina-EDTA 0.25% al frasco T25 y llevarlo a la incubadora 37°C por un tiempo de 2 hasta 3 minutos. Retirar el frasco T25 fuera de la incubadora, revisar desprendimiento bajo microscopio invertido y tapear o golpear el frasco T25 hasta desprender las células y añadir inmediatamente 3 ml de medio de cultivo completo (para inhibir la tripsina por uso de SBF) Re suspender y remover todas las células del frasco y transferir a tubo cónico de 15ml etiquetado con el código del paciente. Agregar 3ml más de medio de
