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PRÁCTICA Nº 07
SISTEMAS DE ÓXIDO REDUCCIÓN BIOLÓGICO (deshidrogenasas). DEMOSTRACIÓN DE LA EXISTENCIA DE CADENA RESPIRATORIA ( citocromos) MEDIANTE INHIBIDORES I. INTRODUCCIÓN El fundamento de la obtención de energía en los procesos biológicos consiste en la oxidación gradual de los diferentes productos intermediarios del metabolismo (sustratos). La oxidación biológica, discurre en su primera fase como deshidrogenación, de los sustratos y el hidrogeno así formado, o sus electrones son transferidos, entonces a, través de una serie de sistemas enzimáticos acoplados secuencialmente. Tan solo en la fase final se produce una verdadera oxidación con la participación del oxígeno respiratorio, que en ultimo termino es el que capta los electrones y los hidrógenos. La formación de agua que tiene en esta reacción va ligada a una ganancia de energía. La oxidación biológica transcurre en cuatro etapas, desde que se introduce en el proceso un carbohidrato, como la glucosa. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA La fosforilación oxidativa, es el proceso por el que se forma ATP, cuando se transfiere los electrones, hacia el NADHH o FADH 2 y finalmente al O 2 mediante una serie de transportadores de electrones. (^) La directriz de la fosforilación oxidativa es el potencial redox entre el NAD+^ y el oxígeno molecular que es de 1,14 voltios ya que el potencial redox del NAD+^ es de - 0.32 voltios y del oxígeno de -0, voltios. NAD+^ + 2 H+^ + 2 e-^ -------------------------- NADHH E° = - 0,320 V ½ O 2 + 2 H+ + 2 e- ----------------------------H 2 O E° = + 0,82 V Para eliminar H+^ y e- NADHH -------------------------------------------- NAD+^ + 2 H+^ + 2 e-^ E° = + 0,320 V ½ O 2 + 2 H+ + 2 e- ----------------------------- H 2 O E° = + 0,82 V NADHH + ½ O 2 ------------------------------------------------------ NAD+^ + H 2 O E° = + 1,14 V La energía libre de oxidación que se libera en la transferencia de 2 H+ y 2 e- del NADHH al O 2 viene dado por la fórmula: ∆G° = - n F ∆Eo ∆G° = - 2 x 96,500 j / vol x 1,154 vol ∆G° = - 220 Kj
En los organismos superiores, los transportadores intermediarios establecidos de la cadena respiratoria están formados por NAD-FMN-FAD – CoQ - Citocromos (b, c 1 , c, a, a 3 ) y proteínas con hierro no hémico Fe 2 S 2. El proceso comienza con una transferencia de electrones de un sustrato reducido (Piruvato, Isocitrato- alfa-cetoglutarato, succinato, malato) a NAD o FAD según sea la deshidrogenasa inicial dependiente de NAD o FAD; los electrones de la flavina (FAD), luego son transferidos a la CoQ y de allí se transfiere en un orden especifico a los citocromos (b, c 1 , c, aa 3 ) y finalmente terminan en el oxígeno que es el aceptor final. Se ha obtenido pruebas experimentales directas de diferentes maneras, una de ellas comprende el uso de inhibidores respiratorios que interrumpen el flujo de electrones en sitios específicos a lo largo de la cadena. II. OBJETIVOS
- Demostrar la oxidación del succinato de sodio mediante la reducción del 2,6- diclorofenolindofenol.
- Demostrar la acción de los citocromos en la transferencia de electrones por la oxidación de la p-fenilendiamina. III. MATERIALES Y EQUIPO Materiales Gradillas Tubos de ensayo Pipetas graduadas de 1 mL, 2 mL, 5 mL y 10 mL Algodón Marcador de vidrio Equipos Cronómetro Licuadora Refrigeradora Centrifugadora IV. MUESTRA BIOLÓGICA Piezas de hígado de ave. A partir de esta muestra se preparará el respectivo homogenizado de hígado. Piezas de corazón de ave. A partir de esta muestra se preparará el respectivo homogenizado de corazón.
NH
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VIII. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
o SISTEMA I: No hay presencia de enzima, por eso no hay nada que deshidrogenice al succinato, por ello no hay cambio de color por parte del redox, ya que este está conservando su estado oxidado (color azul), si hubiera habido presencia de la enzima succinato deshidrogenasa los hidrógenos del succinato hubieran sido removidos al redox y este habría pasado a su forma reducida, evidenciándose con el cambio de color. o SISTEMA II: Gracias a la presencia de la enzima y ausencia de inhibidor, se pudo dar la deshidrogenación del succinato, pasando así sus hidrógenos al redox y convirtiéndolo en su forma reducida, que se evidencia con la decoloración del color azul o SISTEMA III: Hay presencia de malonato el cual viene a ser un inhibidor competitivo del succinato por poseer estructura similar, es así que al principio no habrá cambio de color porque la enzima succinato deshidrogenasa ha sido inhibida, pero al pasar los minutos se observa una decoloración y ello porque hay reversibilidad, ósea la enzima tiene la capacidad de remover el inhibidor y unirse con su sustrato para deshidrogenarlo, por tanto el redox capta los hidrógenos removidos del succinato y se da el color azulado característico de su forma reducida. Cabe mencionar que en este sistema el inhibidor (malonato) solo ha retardado la actividad enzimática. 2H+^ 2e^ - NH 2 Indicador redox p-fenilendiamina Forma reducida: aspecto Forma oxidada: color marrón violáceo
o SISTEMA IV: En este sistema no hay homogenizado cardiaco, por tanto, no hay mitocondrias y cadena de citocromos donde está la coenzima Q que es la encargada de captar electrones y protones. Es por ello que la paradenildiamina mantiene su estado reducido (sin color) o SISTEMA V: La parafenildiamina tiene posibilidad de convertirse en el falso sustrato, ya que tiene la característica de autooxidarse, pierde fácilmente sus protones y electrones que será recibido por la coenzima Q, al no haber ningún inhibidor, se sigue el traslado de electrones a través del complejo 3 y 4 para finalmente enlazarse con el oxígeno, es así que la parafenildiamina logra su forma oxidada (color marrón violáceo) o SISTEMA VI: Presenta malonato el cual es un inhibidor del succinato deshidrogenasa que forma parte del ciclo de Krebs, más no es un inhibidor del citocromo, por tanto, no hay bloqueo alguno y se da con normalidad el proceso de oxidación de la parafenildiamina (color marrón violáceo) o SISTEMA VII: Al haber presencia de cianuro, se bloquea el complejo 4 o llamado también citocromo oxidasa, por tanto, hay impedimento para seguir trasmitiendo los electrones hacia el oxígeno y es por ello que la parafenildiamina queda en su forma reducida (sin color) IX. REACCIONES QUÍMICAS o SISTEMA I: o SISTEMA II: o SISTEMA III:
Se producen 6 moléculas de agua al final de la cadena de transporte de electrones, cuando el oxígeno actúa como el aceptador final de electrones y se combina con protones. c) ATP (Energía): En condiciones óptimas, se producen aproximadamente 30-32 moléculas de ATP por molécula de glucosa: oGlucólisis: 2 ATP (netos) y 2 NADH (que equivalen a ~5 ATP en la cadena de transporte de electrones). oCiclo de Krebs: 2 ATP (como GTP) y NADH/FADH₂ que generan ~23 ATP en la cadena de transporte de electrones. d) NADH y FADH₂: Estos transportadores de electrones intermedios son generados durante la glucólisis, la conversión del piruvato en acetil-CoA y el ciclo de Krebs, y transfieren electrones a la cadena respiratoria para generar ATP.
- Balance general del catabolismo aeróbico de la glucosa: 2. Describa cuáles son los citocromos que forman parte de cadena respiratoria y cuál es su participación en el proceso denominado fosforilación oxidativa. Señale su importancia. Los citocromos son proteínas que contienen un grupo hemo y forman parte de la cadena de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna. Son esenciales en la fosforilación oxidativa, ya que transfieren electrones a través de la cadena hacia el oxígeno, que actúa como el aceptador final de electrones. CITOCROMOS PRINCIPALES Y SU FUNCIÓN: Citocromo b o Se encuentra en el complejo III (complejo de la citocromo reductasa o complejo citocromo bc₁). o Recibe electrones de la ubiquinona (Q) y los transfiere al citocromo c a través de un ciclo llamado ciclo Q. o Su participación ayuda a bombear protones hacia el espacio intermembrana. Citocromo c₁ o También forma parte del complejo III. o Transfiere los electrones del citocromo b al citocromo c, una proteína periférica soluble. Citocromo c o Es una proteína móvil que transporta electrones entre el complejo III y el complejo IV (citocromo c oxidasa). o Es crucial para conectar los dos complejos y garantizar el flujo continuo de electrones. Citocromo a y a₃ o Forman parte del complejo IV (citocromo c oxidasa). o Este complejo acepta electrones del citocromo c y los transfiere al oxígeno molecular (O₂), reduciéndolo para formar agua (H₂O). o Durante este proceso, el complejo IV bombea protones al espacio intermembrana. PARTICIPACIÓN EN LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA: La fosforilación oxidativa se refiere al proceso mediante el cual la energía liberada durante el transporte de electrones es utilizada para sintetizar ATP. Los citocromos son fundamentales porque: Facilitan el transporte secuencial de electrones a través de la cadena respiratoria. Ayudan a crear un gradiente electroquímico de protones (fuerza protón-motriz) mediante el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Este gradiente impulsa la síntesis de ATP por la ATP sintasa. IMPORTANCIA: Producción eficiente de energía: Los citocromos permiten el flujo controlado de electrones, maximizando
la generación de ATP. Rol esencial en el metabolismo aeróbico: Sin los citocromos, el oxígeno no podría ser reducido y el metabolismo aeróbico no sería posible. Regulación de la homeostasis redox: Los citocromos participan en la transferencia de electrones sin liberar radicales libres en exceso, protegiendo la célula del daño oxidativo
3. Presente 3 ejemplos y el mecanismo de acción de los agentes desacoplantes de la cadena respiratoria. Los agentes desacoplantes de la cadena respiratoria son compuestos que interrumpen el acoplamiento entre el transporte de electrones y la síntesis de ATP. Actúan disipando el gradiente de protones generado por la cadena de transporte de electrones, lo que impide que esta energía sea utilizada por la ATP sintasa para sintetizar ATP. En cambio, la energía se disipa en forma de calor. EJEMPLOS Y MECANISMOS DE ACCIÓN:
- Dinitrofenol (DNP): Mecanismo de acción: DNP es una molécula lipofílica que puede atravesar la membrana mitocondrial interna. o En el espacio intermembrana, captura protones (H ), y al ingresar en la matriz mitocondrial, los⁺ libera. o Esto colapsa el gradiente de protones necesario para que la ATP sintasa genere ATP. o El transporte de electrones continúa, pero la energía liberada se convierte en calor en lugar de sintetizar ATP. Efecto: Pérdida de eficiencia energética y aumento de la temperatura corporal. Su uso puede ser letal.
- Termogenina (UCP1): Mecanismo de acción: La termogenina es una proteína desacoplante natural que se encuentra en el tejido adiposo marrón. o Forma canales que permiten el flujo de protones de regreso a la matriz mitocondrial sin pasar por la ATP sintasa. o La energía del gradiente de protones se libera como calor, lo que contribuye a la termogénesis no temblorosa (producción de calor en el organismo). Efecto: Ayuda a regular la temperatura corporal, especialmente en recién nacidos y animales en hibernación.
- FCCP (Carbonil-cianuro-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona): Mecanismo de acción: FCCP es un desacoplante sintético muy potente. o Funciona como un ionóforo, transportando protones a través de la membrana mitocondrial interna. o Esto disipa el gradiente de protones y reduce la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa. Efecto: Se utiliza experimentalmente para estudiar el consumo de oxígeno y la capacidad máxima de la cadena respiratoria. IMPORTANCIA FISIOLÓGICA Y TÓXICA: Fisiológica: La termogenina y otros desacoplantes naturales tienen un papel crucial en la regulación de la temperatura y la adaptación metabólica. Tóxica: Los desacoplantes sintéticos como el DNP y el FCCP pueden ser peligrosos debido a su efecto descontrolado en la producción de calor y el agotamiento de la energía celular, lo que puede causar daño celular o la muerte. XI. CONCLUSIÓN: Se demostró la oxidación del succinato de sodio mediante la reducción del 2,6 diclorofenolindofenol.y se demostró la acción de los citocromos en la transferencia de electrones por la oxidación de la p- fenilendiamina.
