Estructura de glicoconjugados de flavonoides por espectrometría de masas, Apuntes de Química

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Caracterización estructural

de glicoconjugados de

flavonoides

y sus derivados con técnicas

de espectrometría de masas

1. Introducción

La versatilidad de los métodos de espectrometría de masas se basa en la posibilidad de aplicar diferentes fenómenos físicos para la ionización de las moléculas analizadas, la generación de sus fragmentos y la separación de los iones creados. En las dos últimas décadas se ha producido un rápido desarrollo de las técnicas de espectrometría de masas que permiten el análisis de productos naturales de bajo peso molecular con propiedades fisicoquímicas diferenciadas. La facilidad de hibridación de los espectrómetros de masas con diferentes instrumentos cromatográficos hace que sea sencillo realizar análisis de compuestos presentes en complicadas mezclas obtenidas tras la extracción de material biológico. En muchas aplicaciones que combinan la cromatografía de gases, cromatografía de líquidos y electroforesis capilar con espectrometría de masas (GC-MS, LC-MS o CE-MS, respectivamente) se pueden aplicar diferentes métodos de ionización. Numerosos métodos de utilización de la espectrometría de masas en diferentes áreas de las ciencias biológicas relacionadas con la biomedicina la agricultura y los problemas medioambientales y ecológicos se han establecido durante los últimos veinte años. Las técnicas de espectrometría de masas se aplican para controlar los metabolitos primarios y secundarios en la investigación básica y aplicada de la era post genómica.

Figura 1. Estructuras básicas de las agliconas de: (A) flavonoides; y (B) isoflavonoides. Las flechas indican posiciones de las modificaciones comunes de las agliconas: hidroxilación, metilación, acilación, prenilación y O- y C-glicosilación; (C) Principales tipos de estructuras de flavonoides.

2. Concepto/flujo de trabajo para el análisis

de agliconas de flavonoides y sus derivados,

Requisitos instrumentales

Cromatografía de gases (aplicable sólo para estudios de agliconas libres), diferentes métodos de cromatografía líquida (HPLC y UHPLC) o la electroforesis capilar pueden utilizarse en estos estudios. Los analizadores de EM de alta resolución (tiempo de vuelo (ToF); instrumentos Orbitrap) aplicados en LC-MS son muy útiles en la caracterización estructural de los flavonoides, ya que proporcionan la composición elemental de los iones moleculares y sus fragmentos.

El análisis de los glucoconjugados de

flavonoides y de las agliconas libres

suele realizarse en muestras

extraídas de material biológico como

tejidos vegetales de diferentes

órganos: hoja, raíz, flores o de

fluidos biológicos como sangre y

orina. Por esta razón, se aplican

varios métodos de separación para la

elaboración de perfiles y la

caracterización estructural de estos

compuestos y se combinan con

espectrómetros de masas.

3. MSn en el análisis de

flavonoides

La fragmentación múltiple en la

espectrometría de masas puede

lograrse mediante el uso de

espectrómetros de masas con

trampa de iones. En este tipo de

analizadores, los iones son

atrapados en un campo eléctrico y

fragmentados secuencialmente.

De esta manera es posible obtener fragmentos

consecutivos, dando más posibilidades para

describir dependencias estructurales de

determinadas moléculas. Para el análisis de los

flavonoides y sus derivados esto es de especial

importancia, especialmente cuando se

necesita caracterizar las agliconas de

flavonoides presentes en diferentes

combinaciones.

Durante el experimento MS2, normalmente sólo los enlaces lábiles se

fragmentan en CID y es necesario repetir el paso de fragmentación para

otro ion, ya fragmentado en el experimento de fragmentación anterior.

La fragmentación MS3 de los C-glicósidos también se presentó como útil para el análisis de este tipo

de compuestos, en el que se identificaron 53 compuestos en diferentes extractos de plantas, para

la identificación de antocianinas basándose en la fragmentación característica hasta MS3.

Este último caso es especialmente interesante, ya que los C-glicósidos suelen sufrir una

fragmentación diferente a la de los O-glicósidos, dando lugar a la ruptura de los enlaces internos de

los anillos de azúcar.

MSn se aplicó con éxito en la elucidación estructural de isoflavonas agliconas, así como en la

identificación de los glicósidos C de las isoflavonas genisteína y 20 -OH de la genisteína.

En el caso de los conjugados de flavonoides, es necesario al menos el análisis de MS3 para la

identificación de agliconas. En este enfoque, en los primeros pasos de la fragmentación, la mayoría

de los enlaces glicosídicos lábiles que conducen a la formación del ion aglicona libre.

En este modo, los iones de los O-glicósidos de flavonoides se degradan antes de ser introducidos en el analizador de masas para que los fragmentos derivados puedan ser separados y fragmentados en cámara CID. Este enfoque suele denominarse modo pseudo-MS3 y se utiliza con éxito, por ejemplo en sistemas de MS en tándem q-ToF. La desventaja de este enfoque es, por supuesto, la falta de trazas puras de MS y sin un análisis de MS adicional es difícil concluir qué compuesto es la fuente de la determinada aglicona dada. Los isómeros posicionales de las agliconas con varios patrones de hidroxilación pueden distinguirse gracias a los análisis MSn o pseudo MS3 (Figura 2). Figura 2. Diferenciación de las agliconas isoméricas de flavonoides en los glucoconjugados de MS2 o pseudo MS3 de los espectros: (a) genisteína 7-O-glucósido; y (b) apigenina 7-O-glucósido

4. Parte glicosídica de los glucoconjugados de flavonoides

Los azúcares que sustituyen a las agliconas de los flavonoides son mono- a oligosacáridos compuestos por

hexosas, principalmente glucosa, manosa o galactosa, sus 6-deoxiderivados como la chinovosa, la fucosa o la

ramnosa, respectivamente, y pentosas, por ejemplo, arabinosa, apiosa o xilosa.

En raras ocasiones, también se ha notificado

la presencia de otros azúcares como los

dideoxihexósidos, como el digitopiranósido y

el boivinopiranósido de la luteolina y la

apigenina de Passiflora edulis.

Figura 3. Nomenclatura de fragmentos aplicada en este trabajo para: O-glicósidos (A); y C,O- y Cglicósidos (B). 1,3A0 y 1,3B0 se refieren a fragmentos de agliconas que contienen anillos A y B, respectivamente, y superíndices 1 y 2 indican los enlaces de anillos C rotos. Ai, Bi y Ci se refieren a fragmentos que contienen fragmentos de glicósidos, con cargas retenidas en la fracción de carbohidrato, donde i representa el número de enlaces glicosídicos rotos, contados a partir del azúcar terminal. Xj, Yj y Zj se refieren a los iones que contienen la aglicona y j es el número del enlace interglicosídico roto, contado a partir de la aglicona.

Figura 4. Espectros MS2 de disociación inducida por colisión (CID) de compuestos isobáricos y/o isoméricos con diferentes patrones de glicosilación: genisteína 7-O-glucosilglucósido (a); genisteína O,C-diglucósido (b) genisteína 6,8-C-diglucósido (c); apigenina 40,7-O-diglucósido (d); apigenina 7-O-glucosilglucósido (e); y crisoeriol O-xilosilglucósido (f), registrados en un sistema LC/MS equipado con un espectrómetro q-ToF