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OBJETIVO
El objetivo de esta práctica es extracción y purificación d que sea capaz de describir y explicar
INTRODUCCIÓN
La extracción y purificación de los ácidos mayoría de los estudios de Para manipular o amplificar celulares que pueden interferir con los experimentos lípidos, sin dañar al ADN. El primero en Johann Friedrich Miescher ( de los glóbulos blancos varias moléculas ricas en fosfatos, a las cuales les llamó nucleínas (ácidos nucleicos obtenido no era puro. L preocupaciones, por lo que modificó su protocolo agregando pepsina proteasa, para digerir las proteínas presentes
Figura 1.
Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos nucléicos, los cuales son seleccionados según:
- El tipo de ácido nucleico total, ARN mensajero, etc
PRÁCTICA No. 1 Aislamiento y purificación de ADN genómico
objetivo de esta práctica es que el alumno conozca los fundamentos extracción y purificación de ADN genómico, usando levadura como modelo sea capaz de describir y explicar cada una de las etapas del protocolo
purificación de los ácidos nucleicos es el primer paso en mayoría de los estudios de Biología Molecular (Figura 1). Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los experimentos, como proteínas, El primero en aislar y purificar el ADN fue el químico suizo Johann Friedrich Miescher (1844-1895). En 1869, Miescher aisló a partir del núcleo varias moléculas ricas en fosfatos, a las cuales les llamó nucleicos). El protocolo original de Miescher era burdo y
. La contaminación con proteínas era un por lo que modificó su protocolo agregando pepsina proteasa, para digerir las proteínas presentes.
Figura 1. Obtención de ADN genómico.
Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los dos nucléicos, los cuales son seleccionados según: nucleico a extraer (ADN genómico, ADN plasmídico, , etc.)
PRÁCTICA No. 1 Aislamiento y purificación de ADN genómico
fundamentos de la como modelo, y del protocolo.
es el primer paso en la
otros componentes como proteínas, ARN y fue el químico suizo a partir del núcleo varias moléculas ricas en fosfatos, a las cuales les llamó El protocolo original de Miescher era burdo y el ADN era una de sus por lo que modificó su protocolo agregando pepsina, una
Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los
plasmídico, ARN
PRÁCTICA No. 1 Aislamiento y purificación de ADN genómico
- El organismo de donde se extraerá (células animales, plantas, levaduras, bacterias, virus, etc.)
- El material de extracción (órganos completos, tejidos, cultivos celulares, sangre, muestras ambientales, etc.)
- Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificación, etc.)
- La aplicación posterior (amplificación, clonación, expresión, transcripción reversa, etc.)
a. Extracción de los ácidos nucleicos La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere la homogeneización de los tejidos, en su caso, el lisado de las células y la inactivación de las nucleasas celulares que podrían digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN intacto obtenido sea la máxima. La homogeneización y la lisis celular deben ser lo suficientemente fuertes para romper el tejido, la pared y las membranas celulares, pero ser suave para preservar los ácidos nucleicos. Los procesos más comunes son:
- Disrupción mecánica, por ejemplo la molienda, ruptura hipotónica, o congelación-descongelación.
- Tratamiento químico, por ejemplo la lisis con detergentes o agentes caotrópicos.
- Digestión enzimática, por ejemplo con proteasas, lisozima o mutanolisina.
La ruptura celular y la inactivación de nucleasas intracelulares deben de ser combinadas. Se puede utilizar una solución con detergentes para solubilizar las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros componentes celulares como lípidos, azúcares y proteínas, se disuelven en la solución de lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga eléctrica es lo que hace soluble a esta molécula.
b. Purificación de los ácidos nucleicos Los protocolos de purificación de los ácidos nucleicos a partir de los extractos celulares frecuentemente son combinaciones de métodos.
Extracción/precipitación
- Extracción con solventes para eliminar contaminantes, un ejemplo es la combinación de fenol y cloroformo para eliminar proteínas.
- Precipitación selectiva mediante la utilización de altas concentraciones de sal o cambios en el pH para precipitar las proteínas.
- Precipitación de los ácidos nucleicos con isopropanol o etanol, dado que el ADN es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El ADN
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Práctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver “Seguridad en el laboratorio de
Biología Molecular” al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
El día anterior a la práctica:
- Verificar que se cuenta con todas las soluciones necesarias.
- Inocular la levadura en tubos con 5 mL de medio YPD.
- Incubar durante toda la noche en el agitador orbital a 120 rpm y 30 °C.
El día de la práctica:
- Transferir 1.5 mL de cultivo a un tubo de 1.6 mL.
- Centrifugar a 13,000 rpm por 1 min.
- Remover completamente el medio de cultivo con la ayuda de una micropipeta. Si es necesario, volver a centrifugar por 30 s.
- Resuspender la pastilla en 50 μL de buffer STES.
- Agregar ≈ 50 μL de perlas de vidrio en el tubo con las levaduras resuspendidas y agregar 20 μL de buffer TE.
- En campana de extracción, agregar 60 μL de fenol:cloroformo y agitar por vórtex durante 1 min.
El fenol es extremadamente tóxico y debe trabajarse en campana de extracción (ver “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular” al final del Manual).
- Centrifugar a 13,000 rpm por 5 min a temperatura ambiente.
- Transferir la fase acuosa (superior) a un tubo de 1.6 mL nuevo.
- Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto y 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M para precipitar el ADN. Agitar y dejar reposar por 15 min en hielo.
- Recuperar el precipitado por centrifugación a 13,000 rpm por 10 min a 4 °C.
- Remover el sobrenadante por aspiración y enjuagar la pastilla con 100 μL de etanol al 70%.
- Centrifugar los tubos a 13,000 rpm por 1 min.
- Remover el sobrenadante por aspiración. Dejar secar la pastilla al aire por 15 min.
- Disolver la pastilla suavemente sin vórtex en 40 μL de buffer TE.
RESULTADOS
Observe y documente los cambios físicos de la muestra durante todo el proceso de extracción y purificación.
Describa la diferencia entre las pastillas obtenidas de la centrifugación de la levadura, de la levadura lisada y de la obtención de los ácidos nucleicos.
Diga por qué es necesario colocar los tubos que se van a centrifugar con la unión de la tapa hacia la parte externa de la centrífuga y su relación con el lugar donde se formará la pastilla.
CUESTIONARIO
- ¿Cuál es la diferencia entre ADN genómico y ADN cromosómico?
- Mencione 2 medios de cultivo diferentes al YPD que podría utilizar para propagar levaduras.
- ¿Qué son las nucleasas?
- ¿Qué son la lisozima y la mutanolisina?
- ¿Qué papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extracción y purificación?
- Describa cuál es el objetivo de cada unas de las siguientes etapas:
- Lavado de las células
- Adición del buffer STES
- Adición de fenol:cloroformo
- Precipitación con etanol
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
- Medio YPD (250 mL) Extracto de levadura 10 g/L; peptona 20 g/L; dextrosa 20 g/L, en agua destilada, pH ajustado a 6.5. Esterilizar por autoclave y guardar a temperatura ambiente.
- Tris-HCl 1 M pH 7.6 (100 mL) PMTris 121. Disolver 12.1 g de Tris base en 80 mL de agua Milli-QTM, ajustar el pH a 7. agregando alrededor de 4 mL de HCl concentrado. Ajustar el volumen a 100 mL. Esterilizar por autoclave en un frasco de vidrio con tapón de rosca. Si al momento de utilizar esta solución tiene color amarillo, será necesario preparar una nueva. Antes de usar el ácido clorhídrico, consulte la sección de “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular”.
- EDTA 0.5 M pH 8 (250 mL)
Mezclar volúmenes iguales de fenol equilibrado* y cloroformo. Guardar la solución en una botella con la tapa no muy apretada a 4 °C. Antes de usar el fenol y el cloroformo, consulte la sección de “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular”.
- Tratamiento del fenol El fenol antes de ser utilizado debe ser equilibrado a pH > 7.8 ya que el ADN se dirige a la fase orgánica en pH ácidos. El fenol debe ser guardado a -20 °C.
Utilice guantes y bata de laboratorio en todo momento. El fenol puede causar quemaduras severas y daño en la ropa. Trabájese en campana de extracción.
- Sacar el fenol del congelador y esperar a que llegue a la temperatura ambiente, fundirlo calentándolo a 68 °C.
- Agregar hidroxiquinolina a una concentración final de 0.1%, (p/v) este compuesto es un antioxidante, inhibidor parcial de ARNasas y un quelante débil de iones metálicos; además su color amarillo proporciona una fácil forma de identificar la fase orgánica.
- Agregar un volumen igual de Tris-HCl 0.5 M pH 8.0. Agitar la mezcla con una barra magnética por 15 min. Dejar de agitar. Quitar la fase acuosa (fase superior).
- Agregar al fenol un volumen igual de Tris-HCl 0.1 M pH 8.0. Agitar con barra magnética por 15 min. Quitar la fase acuosa. Repetir las extracciones con este buffer hasta obtener un pH > 7.8 en la fase fenólica (medir el pH con papel pH).
- Una vez que el fenol se ha equilibrado y se ha removido todo el buffer, agregar 0.1 volumen de Tris-HCl 0.1 M pH 8.0 con 0.2% v/v de β-mercaptoetanol.
La solución debe ser guardada en una botella ámbar con la tapa no muy apretada a 4 °C hasta por 1 mes.
OBJETIVO
El objetivo de esta práctica es principios básicos de la PCR el uso de un termociclador.
INTRODUCCIÓN
En 1983, el bioquímico Kary Mullis desarrolló la té que desde entonces ha revolucionado la investigación biológica y médica, lo que le llevó a recibir el premio Nobel de Química de 1993. Esta técnica, denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR transformó a la Biología multidisciplinaria. Muchas de las la invención de la PCR para amplificar fragmentos de ADN consumían mucho tiempo y requerían un alto nivel de por lo que en algunos campos de la B
La PCR es una técnica que replica enzimáticamente al ADN que una pequeña cantidad de moléculas de ADN ( amplificadas selectivamente de manera exponencial ( principales razones por las cuales la PCR es una herramienta tan poderosa es su simplicidad y especificidad.
Figura 1. Amplificación exponencial del ADN por PCR.
El primer paso crítico es la selección del ácido nucleico amplificará la secuencia de interés o templado. Por lo general, la PCR está diseñada para permitir la amplificación
PRÁCTICA No. 6 Reacc
ica es que el alumno conozca y sea capaz de explicar los principios básicos de la PCR, así como de realizar una amplificación estándar con termociclador.
En 1983, el bioquímico Kary Mullis desarrolló la técnica de Biología M que desde entonces ha revolucionado la investigación biológica y médica, lo que le llevó a recibir el premio Nobel de Química de 1993. Esta técnica, denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), iología Molecular en una herramienta de investigación de las técnicas de Biología Molecular usadas antes de para amplificar fragmentos de ADN eran muy laboriosas, consumían mucho tiempo y requerían un alto nivel de especialización técnica, lo que en algunos campos de la Biología no era práctico ni rentable su uso.
La PCR es una técnica que replica enzimáticamente al ADN in vitro, permitiendo que una pequeña cantidad de moléculas de ADN (molde o templado tivamente de manera exponencial (Figura 1 ). principales razones por las cuales la PCR es una herramienta tan poderosa es su simplicidad y especificidad.
Amplificación exponencial del ADN por PCR. ico es la selección del ácido nucleico a partir del cual se amplificará la secuencia de interés; a este ácido nucleico suele llamársele
. Por lo general, la PCR está diseñada para permitir la amplificación
CTICA No. 6 Reacción en cadena de la polimerasa “PCR
que el alumno conozca y sea capaz de explicar los así como de realizar una amplificación estándar con
Biología Molecular que desde entonces ha revolucionado la investigación biológica y médica, lo que le llevó a recibir el premio Nobel de Química de 1993. Esta técnica, sus siglas en inglés), olecular en una herramienta de investigación usadas antes de eran muy laboriosas, especialización técnica, iología no era práctico ni rentable su uso. , permitiendo o templado) sean Una de las principales razones por las cuales la PCR es una herramienta tan poderosa es su
a partir del cual se ; a este ácido nucleico suele llamársele molde
. Por lo general, la PCR está diseñada para permitir la amplificación
PCR”
La PCR tuvo gran impacto en 4 áreas principales de la Biología Molecular: el mapeo de genes, la clonación, la secuenciación de ADN y la detección de genes. La PCR es ahora utilizada como una herramienta de diagnóstico médico de enfermedades infecciosas o para detectar mutaciones específicas que pueden causar enfermedades genéticas, en las investigaciones criminales para identificar a los sospechosos a nivel molecular, en pruebas de paternidad y en la secuenciación del genoma humano, por mencionar algunos usos.
MATERIALES REQUERIDOS
- Tubos de PCR de 0.2 mL
- Tubos de 1.6 mL estériles
- Micropipetas y puntas de 200, 20 y 2 μL
- Muestra de ADN molde (se recomienda un ADN plasmídico con un inserto que pueda ser amplificado con primers comerciales universales como los derivados de secuencias de M13)
- Agua Milli-QTM^ estéril
- Buffer de PCR 10x con MgCl 2 15 mM
- Mezcla de dNTP’s (a una concentración de 10 mM de cada uno: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Primer 5’ a una concentración de 50 μM - Primer 3’ a una concentración de 50 μM - Taq ADN polimerasa a una concentración de 5 U/μL - Hielo/contenedor - Termociclador - Vórtex - Agarosa grado Biología Molecular - Buffer TBE 0.5x (preparado previamente) - Buffer de carga 5x (preparado previamente) - Marcadores de peso molecular - Cámara de electroforesis horizontal - Fuente de poder - Parafilm - Transiluminador - Fotodocumentador
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Práctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver “Seguridad en el laboratorio de
Biología Molecular” al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
- Rotular 4 tubos de PCR de 0.2 mL: dos para la reacción de PCR problema en duplicado y otros 2 para el control negativo en duplicado (con agua Milli- QTM^ en lugar del ADN). Mantener siempre los tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador.
- Descongelar en hielo el buffer de PCR, los dNTP’s, los primers y el ADN. Mantener el agua Milli-QTM^ en hielo. Agitar con vórtex a los reactivos pero no el ADN ni la enzima.
Sacar la polimerasa del congelador al momento de usarla y mantenerla en hielo en todo momento. Regresar la polimerasa al congelador inmediatamente después de usarla.
- En un tubo de 1.6 mL nuevo estéril y sobre hielo, agregar los ingredientes para hacer el coctel de reacción para las 4 reacciones (problema y control negativo en duplicado), considerando una reacción adicional para que no falte. Seguir el orden indicado comenzando por el agua, omitiendo el ADN y terminando por la polimerasa.
Agitar con vórtex antes de agregar la polimerasa. Después de agregar la polimerasa, mezclar por inversión sin usar vórtex. En la Tabla 1 se muestran los volúmenes necesarios por tubo para una reacción de 100 μL. Calcular los volúmenes requeridos para un coctel de 5 reacciones.
Tabla 1. Componentes del coctel de reacción de PCR.
Componente
Volumen por reacción de 100 μμμμL
Volúmenes requeridos para 5 reacciones de 100 μμμμL
Agua Milli-QTM^ La necesaria para completar a 100 μL/tubo Buffer 10x 10 μL Primer 5’ 50 μM 1 μL Primer 3’ 50 μM 1 μL dNTP’s 10 mM 2 μL ADN molde χ μL* Taq ADN polimerasa 5 U/μL 1 μL
- (^) La información será proporcionada por el profesor, para tener 10 a 50 ng de ADN en la reacción.
- Distribuir en cada tubo el ADN y después el coctel de reacción.
- Mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo y dar un pulso en la centrífuga a los tubos durante 2 segundos para hacer que el líquido quede en el fondo del tubo y se mezclen todos los componentes.
- Programar el termociclador con las condiciones de amplificación necesarias, siguiendo como guía la Tabla 2 mostrada a continuación:
