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Universidad del Valle de México
Reporte 8. Identificación de metabolitos secundarios Rojas Romero Raúl Eduardo, Martínez Castillo Massiel Alejandra,Carreño Sandoval Maximiliano Gildardo, Jorge Macías Mendoza Farmacognosia y Productos Naturales 28/10/ Docente. Antonio Cabreara Edwards Resumen Los alcaloides constituyen una clase diversa de compuestos nitrogenados presentes en numerosas plantas, confiriéndoles propiedades farmacológicas de gran interés. La extracción y caracterización de estos compuestos son fundamentales en el estudio de las plantas medicinales. En esta práctica se llevó a cabo la extracción de alcaloides a partir de una muestra vegetal utilizando metanol como solvente. La elección de este solvente se justifica por su capacidad para solubilizar una amplia gama de compuestos polares y semipolares, incluyendo los alcaloides. Posteriormente, se emplearon pruebas colorimétricas, como la de Mayer, para confirmar preliminarmente la presencia de alcaloides en el extracto. Esta prueba se basa en la formación de un precipitado característico al interactuar los alcaloides con el reactivo de Mayer, que contiene yoduro de mercurio. Para una identificación más precisa, se recurrió a la cromatografía en capa fina (TLC). Esta técnica permite separar los componentes de una mezcla compleja en función de su polaridad. Se utilizó una fase móvil compuesta de acetato de etilo, metanol y agua, que favoreció la separación de los alcaloides presentes en el extracto. La visualización de las manchas en la placa cromatográfica se realizó mediante luz ultravioleta y el reactivo de Dragendorff, el cual forma complejos coloreados con los alcaloides. En el caso específico del romero, aunque contiene alcaloides como la cafeína y la trimetilamina, su perfil químico se caracteriza principalmente por la presencia de aceites esenciales y otros compuestos fenólicos que le confieren propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Los resultados obtenidos en esta práctica indican la presencia de alcaloides en el extracto de romero, tanto por la prueba de Mayer como por la cromatografía en capa fina. El valor de Rf obtenido para la cafeína concuerda con los valores reportados en la literatura, lo que corrobora la presencia de este alcaloide en la muestra. Es importante destacar que, si bien la cromatografía en capa fina proporciona información cualitativa sobre la presencia de compuestos en una muestra, no permite su identificación inequívoca. Para una confirmación estructural definitiva, sería necesario recurrir a técnicas
analíticas más sofisticadas, como la espectrometría de masas o la resonancia magnética nuclear. Palabras Clave: alcaloides, extracción, fitoquímica, cromatografía en placa, Meyer, Draggendorff Introducción Los alcaloides constituyen una clase amplia de metabolitos secundarios de origen vegetal que se caracterizan por su naturaleza básica y la presencia de nitrógeno en su estructura, lo cual les confiere propiedades farmacológicas distintivas y una gran relevancia en la medicina y farmacognosia (Cordell, 2019). Estos compuestos, que incluyen sustancias tan conocidas como la morfina, la cafeína y la quinina, son utilizados en el tratamiento de múltiples patologías debido a sus efectos terapéuticos variados, que abarcan desde la analgesia y la estimulación del sistema nervioso central hasta la actividad antimicrobiana y anticancerígena (Heinrich et al., 2020). En este contexto, la extracción y caracterización de alcaloides de muestras vegetales constituye un paso esencial en el estudio de plantas medicinales, ya que permite identificar y evaluar su potencial bioactivo y su posible aplicación terapéutica. El proceso de extracción de alcaloides es de suma importancia para obtener muestras enriquecidas en estos compuestos, libres de interferencias provenientes de otros componentes de la planta. La extracción con solventes orgánicos como el metanol se realiza en condiciones controladas, como en un baño María, para optimizar la solubilidad y estabilizar los alcaloides en la solución. Este método resulta efectivo para extraer compuestos con características polares y semipolares, lo que permite aislar los alcaloides del resto de los componentes vegetales sin descomponerlos (Grynkiewicz & Gadzikowska, 2008). En esta práctica, la extracción de alcaloides se realiza a partir de 5 gramos de planta pulverizada, exponiéndolos durante 15 minutos a un baño María con 20 mililitros de metanol, una técnica que mejora la eficiencia del proceso al promover una extracción exhaustiva de los componentes solubles en el disolvente. Para la identificación de los alcaloides en el extracto, se emplean pruebas colorimétricas basadas en la precipitación de compuestos alcaloides. El reactivo de Mayer, por ejemplo, es una solución iodada comúnmente usada en farmacognosia para detectar alcaloides mediante la formación de un precipitado blanco o amarillento en presencia de estos compuestos. Este proceso permite la confirmación preliminar de alcaloides en la muestra, ya que la formación del precipitado indica que los compuestos de interés están presentes en el extracto vegetal (Houghton & Raman, 2018). Esta fase es crucial para validar la efectividad del proceso de extracción y dar un primer indicio de la pureza de la muestra, antes de proceder a técnicas analíticas más complejas. Para una identificación más precisa, se recurre a la cromatografía en capa fina (TLC), una técnica de separación sencilla y eficaz que permite el análisis preliminar de mezclas complejas de compuestos. En esta práctica, se utiliza una fase móvil compuesta de acetato de etilo, metanol y agua en una proporción de 100:13.5:10, lo cual favorece la separación de los alcaloides en función de sus polaridades relativas. Mediante la medición del factor de retención (Rf), es posible obtener información preliminar sobre la identidad de los compuestos presentes en la muestra. Además, la visualización de las manchas en la placa cromatográfica se realiza mediante luz ultravioleta, cámaras de yodo o el reactivo de Dragendorff, el cual reacciona específicamente con alcaloides y permite su identificación mediante la aparición de manchas de color característico (Wagner & Bladt, 2019). La cromatografía en capa fina no solo es una técnica accesible y económica, sino que también
Planteamiento del problema Los alcaloides, compuestos nitrogenados con propiedades terapéuticas como efectos analgésicos, antimicrobianos y anticancerígenos, son de gran interés en farmacognosia y farmacología. Sin embargo, su identificación en muestras vegetales es compleja debido a la matriz de la planta y la coexistencia de otros metabolitos, lo cual requiere técnicas analíticas precisas para evitar la descomposición de los alcaloides y preservar su actividad. Así, se hace necesaria una metodología de extracción e identificación eficiente, como la extracción con metanol y pruebas de colorimetría y cromatografía en capa fina (TLC), que facilite la caracterización de estos compuestos. Esta práctica pretende optimizar estas técnicas y evaluar su efectividad en la detección de alcaloides en plantas medicinales. Método
- Se extrajeron 5 gramos de la droga pulverizada mediante baño María durante 15 minutos, utilizando 20 mL de metanol como disolvente.
- Sobre el extracto metanólico obtenido, se realizaron dos pruebas de identificación específicas para alcaloides.
- Se realizó la precipitación de alcaloides empleando un reactivo iodado.
- A 2 mL del extracto metanólico se añadieron 5 gotas del reactivo de Mayer.
- La aparición de un precipitado fue observada como un indicador de la presencia de alcaloides en la muestra. Cromatografía en Capa Fina
- La muestra fue eludida en una placa de cromatografía utilizando una fase móvil compuesta de acetato de etilo, metanol y agua en una proporción de 100:13.5:10.
- Se midió el factor de retención (Rf) de las manchas observadas en la placa.
- Las manchas fueron reveladas mediante exposición a luz UV, cámara de yodo y el reactivo de Dragendorff. En algunos casos, se observó que las manchas correspondientes a ciertos alcaloides desaparecieron de manera gradual. Resultados Para la extracción de los alcaloides optamos por una planta de uso medicinal, el Romero, este fue obtenido de nuestro jardín botánico del cual solo hicimos uso de las hojas de la planta, las cuales llevamos a triturar a una licuadora para obtener un mayor área de contacto al momento de combinar con el solvente. Se pesó un total de 5 g de nuestras hojas
trituradas de romero las cuales colocamos dentro de un vaso de precipitados para añadirle una cantidad de 20 mL de metanol y llevar a baño maría a una temperatura de 40°C, durante este proceso mantuvimos una agitación constante para poder extraer la mayor cantidad de alcaloides. Figura 1. Extracto de alcaloides contenidos en Romero. Se observa una solución verde oscura semejante a la clorofila perteneciente a las plantas, además se desprende un aroma particular de la planta. Al finalizar las hojas perdieron su coloración. Para determinar la presencia de alcaloides de nuestra muestra de romero, en estos caso empleando las pruebas de Dragendroff y Meyer, donde colocamos 2 mL de muestra dentro de un tubo de ensayo y con los reactivos de las respectivas pruebas se añadió de cada uno a su tubo una cantidad de 5 gotas de reactivo. Los resultados de cada una de las pruebas se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Pruebas Cualitativas de identificación de alcaloides Prueba Imagen Descripción Prueba de Dragendorff Obtuvimos una prueba negativa, debido a que al añadir el reactivo no se desarrolló la aparición de una coloración anaranjada en la muestra. Se mantuvo de su coloración inicial. Prueba de Meyer El resultado de la prueba fue positiva, debido que se presenció la aparición de un precipitado blanquecino en el fondo del tubo.
Figura 4. Cromatografía de alcaloides de extracto de romero revelada con luz UV. Del lado izquierdo se usó atropina como muestra control, la cual no se observa ningún tipo de resultado dentro del recorrido. Del lado derecho se colocó nuestra muestra extracto de romero, donde se presencian dos manchas color naranja brillante en la parte superior y en la parte inferior se muestra una mancha verde. Figura 5. Cromatografía de alcaloides de romero revelados con yodo. Observamos del lado izquierdo nuestra muestra control, atropina que solo denoto una mancha inferior con recorrido mínimo de 0.5 cm. Del lado derecho observamos nuestra muestra de extracto, donde se presenciaron dos manchas de recorrido una inferior de 2.8 cm y una superior de 3.6 cm. Una vez obtenidos los recorridos de cada una de nuestras muestras, procedimos a hacer cálculo del factor de retención, lo cual nos ayudará a realizar las comparaciones pertinentes. En este caso al obtener los mismos resultados en nuestras dos placas nos basamos en un promedio. (Tabla 2) Tabla 2. Valores de rf de cromatografías de alcaloides
Puntos de Muestra Rf Punto inferior verde brillante 0. Punto superior naranja brillante 0. ● Cromatografía con fase móvil combinada con reactivo de Dragendorff. En este caso se preparó una placa cromatográfica con nuestra muestra y el punto control con los mejores resultados, el cual fue la atropina, la cual se colocó en una fase móvil preparada como se menciona anteriormente solo que en este caso se le agregan unas gotas de reactivo de Dragendorff. Se dejó correr por un tiempo de 5 min, a simple vista no se observa algún tipo de recorrido, por lo que se sometió a luz UV, donde no se reveló el recorrido ni de la muestra ni del control. Finalmente se reveló con Yodo en este caos la muestra recorre la totalidad de la distancia del recorrida por lo que el resultado obtenido no fue el adecuado. Figura 6. Cromatografía de alcaloides, con reactivo de Dragendorff como eluyente. Observamos que el recorrido por parte de la muestra (Derecha) fue la misma que la de la fase móvil, por lo que no fue la combinación adecuada para poder observar algún tipo de resultado. Análisis de resultados El romero contiene algunos alcaloides, aunque en cantidades relativamente bajas, típicamente alrededor de 0.1% a 0.3%.. Uno de los más conocidos es la cafeína, que, aunque no está presente en grandes cantidades, puede contribuir a sus efectos estimulantes. Otro alcaloide que se encuentra en el romero es la trimetilamina, que también aparece en pequeñas cantidades. ( Robledo, S., 2018) Sin embargo, lo más destacado del romero son sus aceites esenciales y otros compuestos bioactivos, que le confieren propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Así que, aunque tiene algunos alcaloides, su perfil de compuestos activos es más rico en otras sustancias. ( Robledo, S., 2018) ● Prueba de Meyer
Por los resultados obtenidos podemos determinar que en nuestra muestra extraída de romero si existe la presencia de alcaloides debido a los resultados arrojados tanto por la prueba de Meyer y la cromatografía. Conclusión En esta práctica se logró extraer e identificar alcaloides presentes en una muestra de romero, aplicando técnicas específicas de extracción y pruebas de identificación colorimétricas y cromatográficas. Los resultados obtenidos mediante la prueba de Meyer y la cromatografía en capa fina, en la que se registró un valor de Rf experimental cercano al valor teórico de la cafeína, indican de manera confiable la presencia de alcaloides en la muestra. Aunque los alcaloides en el romero se encuentran en bajas concentraciones, la metodología empleada, incluyendo la extracción con metanol en condiciones controladas y la caracterización a través de pruebas de precipitación, demostró ser eficaz en su detección. De este modo, esta práctica cumplió con los objetivos planteados, permitiendo no solo identificar alcaloides como la cafeína en el romero, sino también optimizar el proceso de extracción y aplicar técnicas de análisis fitoquímico adecuadas. Los resultados refuerzan la importancia de combinar métodos colorimétricos y cromatográficos en la identificación de compuestos bioactivos, lo que puede ser valioso en estudios farmacognósicos y en el análisis de plantas medicinales para fines terapéuticos. Referencias
- Robledo, S., Osorio, E., & Muñoz, D. (2018). Alcaloides del romero (Rosmarinus officinalis L.) con actividades neuroprotectoras. International Journal of Molecular _Sciences, 19(6), 1776. https://doi.org/10.3390/ijms
- Meyer, J. J. M., & Afolayan, A. J. (1996). Uso del método de ensayo autográfico TLC_ en la detección de compuestos antifúngicos de plantas. Methods: A Companion to _Methods in Enzymology, 9(3), 382-384. https://doi.org/10.1006/meth.1996.
- Gao, Y., & Li, H. (2016). Optimización de las condiciones cromatográficas y estudio_ de los comportamientos de retención de la cafeína y sus análogos en una columna de modo mixto. Journal of Chromatography A, 1462, 48-57. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2016.07.
- Cordell, G. A. (2019). Alkaloids: Nature's versatile natural products. Academic Press.
- Grynkiewicz, G., & Gadzikowska, M. (2008). Chromatography of alkaloids: An overview. Journal of Chromatography B, 66(2), 282-294.
- Heinrich, M., Barnes, J., Prieto-Garcia, J., & Gibbons, S. (2020). Fundamentals of pharmacognosy and phytotherapy. Elsevier Health Sciences.
- Houghton, P. J., & Raman, A. (2018). Laboratory handbook for the fractionation of natural extracts. Springer Science & Business Media.
- Manske, R. H. F. (2013). The alkaloids: Chemistry and physiology. Elsevier.
- Wagner, H., & Bladt, S. (2019). Plant drug analysis: A thin layer chromatography atlas. Springer.
