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CAPITULO III
VERIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
3.1 ELECTROFORESIS DE ÁCIDO NUCLEICOS
La electroforesis es un término general que se refiere a la técnica de separación o caracterización de moléculas cargadas eléctricamente con base en sus tasas específicas de migración en un campo eléctrico. El proceso es generalmente realizado en una matriz porosa, de modo que las macromoléculas puedan migrar diferencialmente de acuerdo con sus propiedades físicas. Una matriz usada comúnmente en la separación de moléculas de ADN con tamaños entre 100 pb y 30 Kb es la agarosa, una forma de agar altamente purificado. Esta matriz porosa sirve como base a través de la cual, las moléculas se mueven con velocidades diferentes, inversamente proporcionales a su tamaño. Así, cuando más pequeña es la molécula, mayor será la distancia que ella recorre en un determinado periodo de tiempo. Los fragmentos de ADN que tiene carga eléctrica negativa, conferida por la ionización de sus grupos fosfato, migran en dirección al polo positivo. Después de la migración electroforética, todas las moléculas de ADN del mismo tamaño quedan agrupadas en una determinada región del gel y son visualizadas como una banda. El procedimiento puede dividirse en cuatro etapas: preparación del gel, aplicación de las muestras, electroforesis y análisis de los fragmentos separados. La concentración de agarosa en la preparación del gel es seleccionada en función del tamaño de los fragmentos que se desea separar (Tabla 2). Tabla 2. Relación entre la concentración de agarosa y el rango de separación en tamaño molecular del ADN Concentración de agarosa en el gel (%) Eficiencia en el rango de separación de moléculas lineales de ADN (Kb)
- 3 5 .0 – 60. 0
- 6 1.0 – 20. 0
- 7 0 .8 – 1. 0
- 9 0.5 – 7. 0
- 2 0.4 – 6. 0
- 5 0.2 – 3. 0
- 0 0.1 – 2. 0 Fuente: Puerta y Urueña, 2005. Notas introductorias La concentración de agarosa tiene un papel importante en las separaciones electroforéticas, una vez que ella determina la amplitud de los tamaños de los fragmentos que pueden ser separados en ese proceso. La migración de moléculas de ADN en el gel de agarosa depende del voltaje aplicado, el La migración del ADN en el gel de agarosa La tasa de migración de ADN en un gel de agarosa depende de tres factores principales: de la concentración de agarosa en el gel, del voltaje aplicado y de la configuración de las moléculas de ADN. Las moléculas de ADN migran en la matriz de agarosa con tasas diferentes, que son inversamente proporcionales al Log 10 de su tamaño molecular. Así el tamaño molecular de un fragmento de interés puede ser determinado comparándose su movilidad con la movilidad de las moléculas patrón (escalera de tamaño molecular), con tamaños moleculares conocidos.
cual genera un campo eléctrico con una fuerza que es definida por la longitud del gel y por la diferencia de potencial entre sus extremidades (V/cm). La velocidad de migración de ADN es proporcional al voltaje. Cuanto mayor sea el voltaje, mayor es la velocidad de migración. Sin embargo, con voltajes muy altos las moléculas mayores migran con una velocidad proporcionalmente mayor que las menores. Además, altos voltajes causan más imperfecciones en el gel, como diferencias en la intensidad y espesura de las bandas en las diferentes regiones del gel.
Defectos comunes son bandas inclinadas o en forma de U. La inclinación de las bandas acostumbra
ocurrir en las regiones próximas a los bordes. El gel solidificado con altas temperaturas se adhiere a los bordes, tornándose más espeso que el centro, Esas diferencias causan defectos en la migración. Por esa razón, voltajes superiores a 125V (5V/cm) no deben ser utilizadas en sistemas de electroforesis en mini gel. Moléculas de ADN con el mismo tamaño molecular, pero con configuraciones espaciales diferentes, migran a velocidades diferentes en el gel. Así, moléculas circulares superenrolladas (forma I), moléculas circulares pero relajadas por causa de cortes en una cadena (forma II) y moléculas lineales (forma III) presentan migración diferencial. Monitoreo de la electroforesis La primera señal que la corriente eléctrica está pasando por la cámara de electroforesis es la visualización de los productos de la electrólisis del agua, o sea, burbujas de hidrógeno que se forman en el electrodo negativo y el gas oxígeno que surge a partir del electrodo positivo. Minutos después es posible verificar que los colorantes del tampón de aplicación ya están migrando a través del gel, en dirección al polo positivo. La banda que se mueve más rápidamente es la del colorante azul de bromofenol, de color más azulada, la banda que se mueve más lenta es la del xileno-cianol (más verdosa). Tratamiento con bromuro de etidio y cuidados de manipulación El tratamiento con bromuro de etidio es el método más rápido, práctico, sensible y reproducible de detectar ADN en geles de agarosa. Ese agente se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos, fluoresce en naranja (590 nm) cuando es iluminado con luz ultravioleta (260 a 360 nm). Sin embargo, como muchas de las sustancias usadas en laboratorio, el bromuro de etidio es un mutagénico potente y por tanto un serio candidato a ser un compuesto carcinogénico. Los protocolos de este curso que manipulan el bromuro de etidio serán realizados por el monitor, auxiliar de laboratorio o el docente responsable, en áreas especialmente reservadas para este procedimiento. El bromuro de etidio puede ser adicionado cuando la agarosa está en el erlenmeyer en proceso de enfriamiento, puede ser adicionado al tampón de electroforesis cuando está corriendo o el gel puede ser tratado posterior a la corrida electroforética en un recipiente separado. Manipulación y descontaminación del bromuro de etidio
Indicaciones de peligro
H302: Nocivo en caso de ingestión H330: Mortal en caso de inhalación H341: Se sospecha que provoca defectos genéticos Siempre use guantes de nitrilo libres de talco Limite el uso del bromuro de etidio a una región del laboratorio reservada especialmente para ese fin. Después de la coloración del gel use un embudo para descartar la solución de bromuro de etidio en un recipiente oscuro para descarte. Geles tratados y soluciones usadas deben ser manipuladas de acuerdo con protocolos especiales de descontaminación.
Materiales pHmetro Micropipetas de diversos volumenes Balanza analítica Plancha de calentamiento Estufa u horno microondas Cámara de electroforesis Fuente de poder Fotodocumentador o transiluminador Gafas de protección para luz ultravioleta Reactivos y soluciones: Bromuro de etidio, azul de bromofenol (tampón colorante 6X), buffer TEII, buffer TAE 1X, marcador de λHindIII Agua grado molecular Agua destilada estéril Papel parafilm o caja Therazaki Puntas nuevas y estériles de diferentes volumenes Tubos eppendorf de 1.5 mL 1 erlenmeyer para preparación de agarosa Máscara y gorro de protección Guantes de nitrilo Frascos de descarte Libreta de notas
Lápiz marcador (de preferencia sharpie)
Jabón antibacterial Papel toalla Procedimiento para la preparación del gel de agarosa Se debe tener en cuenta que, para preparar una concentración de agarosa determinada, se debe inicialmente pesar el erlenmeyer conteniendo la agarosa disuelta en el tampón (TAE 1X o TBE 1X), después del calentamiento para disolución completa se pesa nuevamente y se completa con el tampón respectivo el volumen perdido por la evaporación. Este procedimiento garantiza la concentración exacta del gel y la homogeneidad de concentración de agarosa entre las corridas.
- Pesar la agarosa para la concentración de 1 % y adicionar tampón TAE 1X en el volumen deseado.
- Disolver la agarosa en baño María, estufa o microondas hasta no observar grumos y observar la solución de color transparente.
- Dejar enfriar hasta que el gel alcance la temperatura aproximada de 50- 60 °C, adicionar 5 μL de solución de bromuro de etidio (colocar la agarosa demasiado caliente puede quebrar o fragmentar la cámara de electroforesis)
- Preparar la bandeja de la cámara de electroforesis colocando el peine deseado, verificando que este nivelada en la superficie del mesón.
- Llenar la bandeja, evitando la formación de burbujas (dispersar la agarosa lentamente)
- Dejar solidificar la agarosa (si no se va a utilizar inmediatamente, se puede sumergir en el tampón TAE 1X y guardar en la nevera para evitar resecamiento del gel, por un tiempo máximo de 24-48 horas. Preparación de la muestra para electroforesis
- Sobre papel parafina o una caja pequeña de Therazaki coloque 2 μL de tampón TE II, 1 μL de azul de bromofenol y posteriormente, adicionar 2 μL de ADN.
- Homogenizar las muestras con cuidado y adicionar cada una, en los pozos correspondientes del gel de agarosa que previamente se debe ubicar en la cámara de electroforesis y que debe estar cubierto con tampón TAE 1X.
Marcador de tamaño molecular
1. En un tubo de microcentrífuga adicionar 2 μL de marcador de tamaño molecular λ Hind III, 6
μL de tampón TE II y 2 μL de la solución tampón colorante 6X.
- Llevar la mezcla a baño María a 65 oC por 10 minutos.
- Transferir el tubo con la mezcla a hielo por 10 minutos.
- Adicionar 5 μL del marcador en la primera y 5 μL en la última posición del gel de agarosa. Corrida electroforética
- Posicionar los electrodos en la cámara de electroforesis (Figura 7 ) de modo que el inicio de la corrida este próximo al electrodo negativo (negro).
- Encender la fuente de energía y seleccionar el voltaje y tiempo de corrida apropiado.
- Realizar la corrida electroforética bajo una intensidad de corriente eléctrica apropiada para la muestra en estudio (Máximo 5 V/cm), calcular el valor para la cámara a utilizarse en esta práctica de laboratorio.
- Después de la corrida apagar la fuente y remover los electrodos.
- Retirar el gel de agarosa de la cámara de electroforesis, con mucho cuidado y usando siempre guantes de nitrilo libres de talco.
- Visualizar en un transiluminador o fotodocumentador y tomar la fotografía usando la extensión tiff.
- Limpiar cuidadosamente toda la superficie que estuvo en contacto con el bromuro de etidio. Reactivos para la electroforesis TE II 10 mM Tris-HCl pH 7. 0.1mM EDTA pH 8. TAE (Tampón Tris-Acetato-EDTA) Solución 50 X (stock) Tris Base 242.0 g Ácido acético glacial 57.1 mL EDTA-Na 2 pH=8.0 100 mL Completar con agua destilada estéril a 1000 mL Solución 1 X (stock) TAE 50X 20 mL Completar con agua destilada estéril a 1000 mL Tampón colorante 6X Azul de bromofenol 0.25 %
Cuestionario
- ¿Cuáles son las dos funciones del tampón de aplicación de la electroforesis?
- ¿Cómo el bromuro de etidio tiñe el ADN? ¿Y cómo es el fundamento con otros colorantes existentes ya en el mercado? ¿Qué sucedería si:
- ¿Si la cámara de electroforesis tuviera agua en lugar de tampón TAE?
- ¿Si se utilizara agua en lugar de tampón TAE en la preparación del gel de agarosa?
