Desoxiadenosina trifosfato. Trifosfato de desoxiguanosina. Desoxicitidina trifosfato
MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER
La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el cebador, la ADN
polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). También se añaden
los cuatro nucleótidos didesoxi terminadores de la cadena, marcados con su pigmento, pero
en cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos normales.
Primero se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN (separar las cadenas) y
luego se enfría para que el cebador pueda unirse al molde de cadena sencilla. Una vez que
se ha unido el cebador, se eleva la temperatura para que la ADN polimerasa pueda
sintetizar ADN nuevo a partir del cebador. La ADN polimerasa añadirá nucleótidos a la
cadena hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno normal. A
partir de ese momento, no es posible agregar más nucleótidos y la cadena termina con el
nucleótido didesoxi.
Este proceso se repite cierto número de ciclos. Cuando los ciclos terminan, está
prácticamente garantizado que se ha incorporado un nucleótido didesoxi en cada una de las
posiciones del ADN blanco en al menos una reacción. Es decir, el tubo contendrá
fragmentos de diferentes longitudes que terminan respectivamente en cada una de las
posiciones de los nucleótidos del ADN original (observa la siguiente figura). Los extremos
de los fragmentos tendrán el pigmento que indica su nucleótido final.
Cuando la reacción termina, los fragmentos se hacen pasar a través de un tubo largo y
delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado electroforesis capilar en gel.
Los fragmentos cortos se mueven rápidamente a través de los poros del gel, mientras que
los fragmentos largos se mueven más lentamente. Cuando cada fragmento cruza la "línea
de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y permite la detección del pigmento asociado.
El fragmento más pequeño (que termina justo un nucleótido después del cebador) es el
primero que cruza la línea de meta, seguido por el próximo fragmento más pequeño (que
termina justo dos nucleótidos después del cebador) y así sucesivamente. De esta manera, se
puede reconstruir nucleótido por nucleótido la secuencia del fragmento de ADN original a
partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el detector. Los datos
registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la
fluorescencia, como se muestra en el cromatograma anterior. La secuencia del ADN se lee
a partir de los picos en el cromatograma.
SEGUNDA DIAPOSITIVA
Usos y limitaciones
La secuenciación de Sanger arroja secuencias de alta calidad para segmentos relativamente
largos de ADN . La técnica suele utilizarse para secuenciar fragmentos individuales de
ADN, como plásmidos bacterianos o ADN copiado en la PCR.
