Determinación de las diferentes clases de enzimas, Monografías, Ensayos de Bioquímica

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Informe N° 5 Laboratorio de Bioquímica Clínica Aplicada Tema: Determinación de las diferentes clases de enzimas SECCIÓN : “B” TURNO : Noche - V ciclo

ÍNDICE

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I. OBJETIVOS:................................................................................................................................ 2 II. MARCO TEÓRICO:................................................................................................................. 2 III. MATERIALES................................................................................................................................ 8 IV. DESARROLLO : ...................................................................................................................... 11 V. Resultados............................................................................................................................... 15

modelo de unión enzima-sustrato más aceptado es el de ajuste inducido, el cual establece que la enzima puede modificar ligeramente la forma de su sitio activo para acomodar mejor al sustrato, optimizando así la reacción. A. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: La actividad enzimática está influenciada por múltiples factores, entre los que se destacan: ● pH: Cada enzima tiene un pH óptimo. Valores fuera de este rango pueden desnaturalizar la enzima o alterar la ionización de su sitio activo. ● Temperatura: Aumentar la temperatura acelera las reacciones, pero temperaturas demasiado altas pueden desnaturalizar la enzima. ● Concentración del sustrato: A mayor concentración de sustrato, mayor será la velocidad de reacción, hasta alcanzar un punto de saturación. ● Presencia de inhibidores: Algunas moléculas pueden disminuir o bloquear la actividad enzimática, actuando como inhibidores competitivos, no competitivos o competitivos. B. CLASES DE ENZIMAS : ● Oxidoreductasas: Catalizan reacciones de oxido-reducción (transfieren electrones) ejem. Deshidrogenasas, Peroxidasa oxidasas, Oxigenasas, reductasas. ● transferasas: Realizan transferencia de grupos, ejm: Kinasas, Transaminasas. ● Liasas: Realizan lisis de un sustrato, generando un doble enlace,ejm: Descarboxilasa pirúvica. ● Ligasas: Forman enlaces C-C, C-N, C-O, C-S. Mediante reacciones de condensación, acopladas a la ruptura de ATP. Ejm: Sintetasa. ● Hidrolasas: Realizan hidrólisis, con transferencia de grupos funcionales de agua, Ejm: Pirofosfatasa, Tripsina, Aldolasa. ● Isomerasas: Realizan transferencia de grupos en el interior de las moléculas para dar formas isómeras, ejem: Mutasas, Epimerasas, Racemasas. C. ¿QUÉ SON LAS OXIDOREDUCTASAS?

Las oxidorreductasas son una clase esencial de enzimas que catalizan reacciones de óxido-reducción, facilitando la transferencia de electrones o átomos de hidrógeno entre dos moléculas. Estas enzimas participan activamente en rutas metabólicas fundamentales como la respiración celular, la fotosíntesis, la fermentación y diversos procesos de detoxificación, siendo clave en el mantenimiento del equilibrio redox en las células. Desde el punto de vista estructural y funcional, muchas oxidorreductasas utilizan coenzimas como NAD , NADP⁺ ⁺ o FAD para llevar a cabo sus funciones catalíticas. Gracias a su alta especificidad y eficiencia, estas enzimas no solo son esenciales en los sistemas biológicos, sino que también han cobrado relevancia en aplicaciones biotecnológicas, industriales y ambientales. En la última década, se ha incrementado el interés científico por las oxidorreductasas debido a su potencial para transformar compuestos contaminantes, participar en procesos de biorremediación y en la producción sostenible de compuestos de valor añadido. Su versatilidad catalítica y la posibilidad de ser modificadas mediante ingeniería enzimática las posicionan como herramientas clave en el desarrollo de tecnologías limpias y eficientes. D. OXIDOREDUCTASAS PRESENTES EN LA LECHE : Las oxidoreductasas presentes en la leche son enzimas que catalizan reacciones de óxido-reducción (redox) y desempeñan funciones importantes tanto biológicas (en el animal) como tecnológicas (en la conservación y procesamiento de la leche). ● Principales Oxidoreductasas de la leche : ❖ Xantina Oxidasa : Se ubica en la fracción grasa de la leche , unida a la membrana del glóbulo graso. Puede generar H₂O₂ como subproducto también interviene en sistemas antimicrobianos naturales. Hipoxantina + O₂ → Xantina + H₂O₂ Xantina + O₂ → Ácido úrico + H₂O₂

F. PARTICIPACIÓN DE LAS OXIDASAS DESHIDROGENASAS EN EL CICLO DE

KREBS :

Las deshidrogenasas actúan extrayendo electrones (en forma de átomos de hidrógeno) de los metabolitos del ciclo, y transfiriendose a coenzimas como NAD⁺ o FAD, generando NADH o FADH₂, que luego llevan esos electrones a la cadena de transporte electrónico mitocondrial. Estas enzimas catalizan pasos clave del ciclo, permitiendo: ★ La oxidación secuencial de los carbonos del acetil-CoA. ★ La reducción de coenzimas que acumulan poder reductor. ★ El flujo de electrones hacia la producción de ATP en la fosforilación oxidativa. ● Principales Deshidrogenasas en el Ciclo de Krebs :

1. Isocitrato deshidrogenasa : Primer paso de descarboxilación del ciclo. Genera NADH.
2. α-Cetoglutarato deshidrogenasa : Paso irreversible, libera otra molécula de CO₂ y genera NADH.
3. Succinato deshidrogenasa : Única enzima del ciclo que está acoplada directamente a la cadena respiratoria (complejo II mitocondrial). Produce FADH₂.

Materiales del estudiante debe de traer Nombre Imagen Leche Hígado Equipos de laboratorio Nombre Imagen Baño María

Reactivos

Nombre Imagen Nombre Imagen Formaldehído Ácido Succínico Azul de metileno Fenol Aceite mineral NaOH al 10% IV. DESARROLLO :

1. Oxidorreductasas (Leche) Paso 1. Paso 2.

• En 10 min comparar el cambio de coloración en ambas muestras. No se evidencio cambio de color en la muestra. Se extiende el tiempo de incubacion por un tiempo adicional de 10 min. (en total 30 min.). para conseguir los resultados que estamos buscando.

2. Oxidorreductasas (hígado) Paso 1. Se procede a pesar 1 g. de hígado para la práctica. Paso 2. Se procede a colocar la muestra al mortero y continuar con el triturado. Paso 3. Añadir 4 ml de Ac. Succínico al hígado molido, hasta obtener una masa. Paso 4 Transferir la masa en 2 tubos en cantidades iguales.

• Añadir los siguientes reactivos de manera ordenada: Tubo (+) Tubo (-) ------------------------------------------- 1 ml Fenol 2 gotas de Azul de Metileno 2 gotas de Azul de Metileno

• En 10 min comparar el cambio de coloración en ambas muestras. Tubo (+) Tubo (-) V. Resultados

1. Resultado de la práctica oxido reductasa como muestra: leche En el caso de la leche, no se observó la decoloración del azul de metileno, lo que indica que no ocurrió una reacción redox visible. Esto podría deberse a que las enzimas oxidoreductasas presentes en la leche estaban inactivas, posiblemente porque la muestra utilizada (leche Gloria) había sido pasteurizada. El tratamiento térmico destruye estas enzimas, impidiendo que actúen. Además, puede que no hubiera suficientes sustratos oxidables disponibles, o que las condiciones del

experimento, como la temperatura o el tiempo de incubación, no hayan sido las más adecuadas para que se produzca la reacción.

2. Resultado de la práctica oxidoreductasa como muestra: hígado En el Tubo 1 (positivo) , que tenía hígado fresco, ácido succínico y azul de metileno, sí se dio la reacción, ya que el azul de metileno se decoloró. Esto pasó porque el hígado contenía una enzima llamada Succinato Deshidrogenasa, que estaba activa. Esta enzima ayudó a que el ácido succínico se transformara en fumarato, liberando protones y electrones: Después, esos electrones pasaron al azul de metileno, que actuó como un indicador y se redujo , cambiando de azul a incoloro: Por eso, el cambio de color nos muestra que sí hubo actividad enzimática y que la reacción redox ocurrió.

También es posible que existieran errores técnicos en la preparación o manipulación de la muestra, lo que habría afectado los resultados obtenidos. Por ejemplo, el uso del azul de metileno como indicador requiere que haya una liberación adecuada de hidrógeno para observar la reducción del color, lo cual solo ocurre si hay participación activa de enzimas específicas como las aldehído oxidasa. Enzimas del hígado: En el caso de las enzimas hepáticas, se obtuvieron los resultados esperados, lo que indica la presencia activa de enzimas en la muestra. Esto sugiere que la enzima oxidoreductasa está presente, ya que al añadir el sustrato, este reaccionó con la coenzima FAD, formando FADH₂. El hidrógeno liberado por el sustrato fue captado por la coenzima, lo cual permitió la reducción del azul de metileno. Este cambio se evidenció por la pérdida de color del indicador, que pasa de su forma oxidada (azul) a una forma incolora, confirmando así la actividad enzimática mediante el cambio visible de color. VII. CONCLUSIONES : ● La baja detección de óxido-reductasas presentes en la leche se debería a su escasa concentración o a daños durante el procesamiento del producto. ● La pérdida de color del azul de metileno confirma la actividad de enzimas oxidoreductasas en la muestra hepática, evidenciando su presencia funcional mediante una reacción visible. ● La determinación enzimática evidenció actividad baja en la leche y activa en el hígado, lo que refleja diferencias en concentración y función enzimática entre ambos tipos de muestra. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Herraéz A. Ciclo de Krebs [Internet]. España. [citado el 27 de mayo de 2025]. Disponible en: https://biomodel.uah.es/metab/Krebs.htm  Enzimas [Internet]. [Citado el 27 de mayo de 2025]. Disponible en: http://www.dcne.ugto.mx/respaldo1/Contenido/MaterialDidactico/QuimicaBioinorg anica/Enzimas.pdf  Berg JM, Tymoczko JL, Gatto GJ, Stryer L. Biochemistry. 8th ed. New York: W.H. Freeman; 2015. Sección 20.3: La Succinato Deshidrogenasa es una enzima del ciclo del ácido cítrico y la cadena de transporte de electrones. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22413/  Fox PF, McSweeney PLH. Dairy Chemistry and Biochemistry. 2nd ed. Springer;

2015. Capítulo 5: Enzymes indigenous to milk. Disponible en: https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4419-8602-  Walstra P, Wouters JTM, Geurts TJ. Dairy Science and Technology. 2nd ed. CRC Press; 2006. Disponible en: https://www.crcpress.com/Dairy-Science-and-Technology/Walstra/p/book/ 9780824727635