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Práctica 1: Espectrofotometría y curvas tipo - Proteínas y Ácido Galacturónico, Ejercicios de Biología Celular

Documento que describe la práctica 1 de Química Análitica sobre el uso del espectrofotómetro para la construcción de curvas tipo de proteínas y ácido galacturónico. El documento incluye objetivos, reactivos y materiales, procedimiento y resultados.

Qué aprenderás

  • ¿Cómo se construye una curva tipo para proteínas y ácido galacturónico?
  • ¿Cómo se utiliza el método Bradford y DNS en la determinación de proteínas y ácido galacturónico?
  • ¿Cómo se utiliza el espectrofotómetro para medir la concentración de proteínas y ácido galacturónico?

Tipo: Ejercicios

2017/2018

Subido el 29/11/2022

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Práctica 1: Espectrofotometría y construcción de curvas tipo
Integrantes:
Mónica Cecilia García Loretz A01360183
María Fernanda López Rivera A01362068
Erika Alexandra Ramos Guadarrama A01182675
Atzin Pamela Sanchez Uriarte A01183563
Fecha: 20 de enero de 2015
Introducción:
La espectrofotometría es un conjunto de técnicas que utilizan la luz para medir
concentraciones de especies químicas. Esto se debe a que las sustancias presentes en
una mezcla absorben luz a una determinada longitud de onda, dependiendo de la
concentración de los solutos presentes y del coeficiente de absortividad molar que
presentan los compuestos. Es decir mide la cantidad de energía absorbida por las
moléculas de la muestra a una longitud de onda determinada y así determinar la
concentración.
Cuando la luz atraviesa una muestra, la cantidad de luz absorbida será la diferencia
entre la radiación incidente y la transmitida, es decir la radiación enviada al inicio y la
cantidad de luz que logró pasar por la muestra. De aquí se deriva la transmitancia (T),
la cual se da en términos de fracción o porcentaje y la absorbancia (A) la cual está
definida en base a la transmitancia y no tiene unidades. (UNAM, 2004)
El coeficiente de extinción molar es característico de cada sustancia en condiciones
específicas, depende igual de las características del instrumento. Por lo que la
construcción de una curva de calibración para la sustancia a analizar es básica.
Éste es el método de análisis óptico más utilizado. Es importante mencionar que
nosotros lo utilizaremos con fines para construcción de una curva tipo la cual es una
curva de referencia elaborada a base de cantidades conocidas de una sustancia y así
determinar la cantidad de la sustancia presente en muestras con concentración
desconocida. (Coto, 2001)
Una curva de calibración lineal que relaciona la absorbancia con la concentración debe
tener:
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Práctica 1: Espectrofotometría y construcción de curvas tipo

Integrantes: Mónica Cecilia García Loretz A María Fernanda López Rivera A Erika Alexandra Ramos Guadarrama A Atzin Pamela Sanchez Uriarte A Fecha: 20 de enero de 2015 Introducción: La espectrofotometría es un conjunto de técnicas que utilizan la luz para medir concentraciones de especies químicas. Esto se debe a que las sustancias presentes en una mezcla absorben luz a una determinada longitud de onda, dependiendo de la concentración de los solutos presentes y del coeficiente de absortividad molar que presentan los compuestos. Es decir mide la cantidad de energía absorbida por las moléculas de la muestra a una longitud de onda determinada y así determinar la concentración. Cuando la luz atraviesa una muestra, la cantidad de luz absorbida será la diferencia entre la radiación incidente y la transmitida, es decir la radiación enviada al inicio y la cantidad de luz que logró pasar por la muestra. De aquí se deriva la transmitancia (T), la cual se da en términos de fracción o porcentaje y la absorbancia (A) la cual está definida en base a la transmitancia y no tiene unidades. (UNAM, 2004) El coeficiente de extinción molar es característico de cada sustancia en condiciones específicas, depende igual de las características del instrumento. Por lo que la construcción de una curva de calibración para la sustancia a analizar es básica. Éste es el método de análisis óptico más utilizado. Es importante mencionar que nosotros lo utilizaremos con fines para construcción de una curva tipo la cual es una curva de referencia elaborada a base de cantidades conocidas de una sustancia y así determinar la cantidad de la sustancia presente en muestras con concentración desconocida. (Coto, 2001) Una curva de calibración lineal que relaciona la absorbancia con la concentración debe tener:

A= k C Donde A= absorbancia C= concentración k= factor de calibración La albúmina sérica bovina es un polipéptido de cadena simple con 59 residuos de lisinas, de 30 a 35 cuentan con aminas primarias capaces de reaccionar con reactivos de conjugación y con numerosos grupos carboxilatos que otorgan su carga negativa neta. La albúmina sérica bovina pertenecen a las proteínas llamadas albúminas, que constituyen aproximadamente la mitad del contenido de proteínas del plasma, son solubles y cuentan con estabilidad alta. Es la proteína más empleada como patrón para calcular la cantidad de proteínas totales en una muestra incógnita. El ácido galacturónico es un monosacárido de 6 átomos de carbono correspondiente a la forma oxidada de la D-galactosa, perteneciente al grupo de los azúcares ácidos. Es el principal componente de las pectinas (Fig.1). Las pectinas son un constituyente importante de los tejidos vegetales y se encuentra principalmente en la pared celular primaria. Las pectinas pueden agruparse en una de las siguientes tres categorías: ● Protopectina: polímero de ácido galacturónico no metilado que se encuentra en las frutas inmaduras. ● Ácido pectínico: polímero de ácido galacturónico metilado, incluye pectinas y se encuentra en las frutas ya maduras. ● Ácido péctico: derivado desmetilado del ácido pectínico de cadena corta que se encuentra en frutas excesivamente maduras. Figura 1. Estructura básica de las sustancias pécticas. El método de DNS para azúcares reductores consiste en una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en la muestra y determinar las absorbancias por medio de un espectrofotómetro. Ésta técnica sirve para cuantificar los azúcares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. El DNS

● Una pipeta de vidrio de 5 o 10 mL. ● Una perilla de látex. ● Un vaso de precipitados de 500 mL. ● Una gradilla para tubos de ensayo. Procedimiento Cuadro 1.1: Construcción de la curva tipo de proteína Tubo H2O (μL) Stock ASB (μL) Bradford (mL) 1 250 0 1 2 200 50 1

3 150 100 1 4 100 150 1 5 50 200 1 6 0 250 1 Cuadro 1.2: Construcción de la curva tipo de ácido galacturónico Tubo H2O (mL) Stock A. gal (mL) Reactivo de DNS (mL) 1 1.0 0.0 1 2 0.8 0.2 1 3 0.6 0.4 1 4 0.4 0.6 1 5 0.2 0.8 1 6 0.0 1.0 1 Resultados y Análisis de resultados Se cambió la concentración de la albúmina, en el protocolo se tenía una concentración de 0.250 mg/mL al doble, es decir 0.500 mg/mL. Cuadro 2.1: Absorbancia de Proteína ASB medida a 595 nm. Concentración Serie 1 Serie 2 Promedio 0.0 0.441 0.456 0. 0.1 0.997 1.036 1. 0.2 1.429 1.422 1.

Cuadro 2.2: Absorbancia de Ácido galacturónico medida a 550 nm. Concentración Serie 1 Serie 2 Promedio 0.0 0.008 0.011 0. 0.2 0.163 0.182 0. 0.4 0.455 0.456 0. 0.6 0.689 0.715 0. 0.8 1.010 0.822 0. 1.0 1.272 1.253 1. Figura 4. Tubos muestra con ácido galacturónico y DNS. Figura 5. Tubos muestra con ácido galacturónico y DNS. Figura 6. Curva tipo de ácido galacturónico

Como ya se mencionó en la literatura el método de DNS es un método colorimétrico por lo que en las figuras 4 y 5 se aprecia como el DNS reacciona con los azúcares reductores generando un producto coloreado y conforme aumenta la concentración del azúcar la intensidad del color de igual manera aumenta. Se construyó una gráfica con los datos obtenidos (cuadro 2.2) a partir de la medición de cada tubo. Al obtener un coeficiente de correlación muestral con valor de 0. comparando con la literatura se indica que es aceptable, por lo que la gráfica (Figura 6) nos servirá posteriormente para la determinación de las concentraciones de muestras. Conclusiones Mediante el uso del espectrofotómetro pudimos calcular curvas tipo tanto como para la proteína ASB como para el ácido galacturónico de las cuales sólo la última nos servirá de referencia para cuantificar en futuras prácticas. Bibliografía

  1. Universidad Nacional Autónoma de México facultad de Química. (2004). Conocimientos de técnicas analíticas. Universidad Nacional Autónoma de México Sitio web: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/cineticapractica6_19764.pdf. Visitado: 20 de enero 2015.
  2. Coto, C. (2001). Las curvas de calibración. Visitado: enero 20, 2015, de Universidad de Buenos Aires. Sitio web: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm.
  3. García, H y Vázquez R. (1998). Cuantificación de proteínas: una revisión. Visitado: enero 20, 2015, de Instituto de Biotecnología UNAM. Sitio web: http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf
  4. Walker, J. (2002) The protein protocols handbook, Humana Press, United Kingdom, 145 pp.
  5. Palma, G. (2001). Biotecnología de la reproducción. Visitado: enero 24, 2015, de Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Sitio web: https://books.google.com.mx/books? id=zmHbayu_hfIC&pg=PA242&dq=albumina+serica+bovina&hl=es- 419&sa=X&ei=RFTFVMiOCtKpyATSzoBQ&ved=0CBsQ6AEwAA#v=onepage&q =albumina%20serica%20bovina&f=false