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TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA (TINCIÓN SIMPLE Y
DIFERENCIAL)
RESUMEN: En este informe de laboratorio, se aplicó la tinción simple de dos bacterias: Escherichia coli y Staphylococus aureus. Utilizando colorantes consecuentes como lo fueron: azul de metileno, Lugol, cristal violeta y safranina, se clasificaron según sus características morfológicas y se clasificaron según su afinidad a la tinción. E coli es una bacteria Gram negativa, mientras que la S.aereus es Gram positiva. El objetivo principal fue comprender los colorantes y como estos interactúan con las estructuras celulares para su diferenciación a la hora de observarlos. Palabras Claves: microorganismos, tinción de Gram, coloración bacteriana, bacterias ABSTRACT : In this laboratoty report, simple staining of two bacteria: Escherichia Coli and Staphylococus aereus was applied. Using consistent dyes such as methylene blue, lugol, crystal violet and safranin, they were classified according to their morphological characteristics and classified according to their affinity to staining. E coli is a Gram-negative bacterium, while S.aereus is Gram-positive. The main objective was to understand dyes and how they interact with cellular structures for differentiation when observating them. Keyswords: microorganism, Gram stain, bacterial staining, bacteria.
1. Introducción La tinción fue y siempre ha sido un elemento fundamental en la historia como un paso primordial utilizados hace más de cientos de años. La tinción de Gram es un ensayo utilizado para identificar bacterias. En este laboratorio pudimos apreciar su diferenciación a partir de este en los correspondiente a su estructura de igual modo, este compuesta por cocos, bacilos, estreptococos según la bacteria observada, y esto gracias a la tinción. OBJETIVOS 1. Diferenciar características morfológicas y la tinción de las bacterias a través de estos métodos. 2. Conocer los fundamentos de diferentes coloraciones utilizados para la observación microscópica de microorganismos. 3. Conocer los pasos de la tinción bacteriana
MATERIALES Y REACTIVOS
- Colorantes (Azul de metileno, Cristal violeta, Carbol fucsina)
- 1 asa de inoculación
- 1 aguja de inoculación
- 1 Mechero de alcohol
- 1 encendedor
- Cinta de rotular
- Marcador (Sharpie)
- Microscopio
- Puente de coloracion
- Frasco lavador
- Aceite de inmersion
- Papel de aroz
- Papel toalla
- Láminas o portaobjetos
- Cultivos en agar de 24 horas de E. coli y Bacillus sp. suministrados por el profesor
PROCEDIMIENTO
- Preparaciones no coloreadas. (Preparación en fresco). a. Cuando la muestra a analizar se encuentra en un medio líquido, proceda así: con el asa estéril deposite una gota de cultivo bacteriano en el centro de un portaobjetos limpio. Coloque un cubreobjetos o laminilla sobre la gota evitando la formación de burbujas. Observe con objetivos de 10X y 40X. Haga esquemas y describa lo observado. b. Si la muestra a analizar se encuentra en medio sólido se debe proceder de la siguiente forma: coloque una gota de solución salina sobre un portaobjetos, toque con el asa una colonia de cultivo y haga con esta muestra una emulsión en la gota. Cubra la preparación con el cubreobjetos. Observe al microscopio. Haga esquemas y describa lo observado.
- Preparaciones coloreadas a. Con colorantes básicos. (Coloración simple o directa). Los colorantes básicos más empleados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, carbofucsina y verde de malaquita. El procedimiento para preparar y fijar las bacterias para Ia tinción es el siguiente: a. Prepare en láminas separadas el frotis de cada microorganismos siguiendo el procedimiento discutido previamente. b. Siguiendo las instrucciones del docente cubra los frotis con el colorante indicado, usando el tiempo de exposición adecuado para cada uno. Carbol fucsina 15 a 30 segundos; cristal violeta 20 a 60 segundos; azul de metileno 1 a 2 minutos. c. Lave el frotis con agua de la llave para remover el exceso de colorante. Coloque la lámina o portaobjetos paralela al flujo de agua para reducir la perdida de microorganismos. d. Seque los alrededores del frotis con papel toalla y deje secar el frotis al aire. e. Repita el procedimiento para cada organismo usando un colorante diferente. f. Examine cada tinción bajo el objetivo de inmersión. RESULTADOS Figura 1. Bacteria E. coli. tinción: Gram negativa, muestra de bacilos.
- Diga cual es la función de Cada uno de los siguientes reactivos en una tinción diferencial: tinte primario, contratinte, agente decolorante, mordiente. Primer colorante : básico, en contacto con las bacterias cargadas negativamente reacciona coloreándolas. Solución mordiente : fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las bacterias. Agente decolorante : disolvente orgánico que se utiliza como lavado para eliminar colorante no fijado. Colorante de contraste : colorante básico de distinto color al primer colorante. Contratinte: se usa para enjuagar el tinte primario
- ¿Por qué es esencial que el colorante primario y el contra tengan colores contrastantes?. R// Porque la función del tinte primario es impartir color a todas las células. Con el objetivo de establecer un contraste de color; el colorante de contraste, le da alas células decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido.
- ¿Cúal cree usted que es el paso más crucial en la coloración de Gram? explique. R// Decolorar con etanol y eliminar el exceso de alcohol (La decoloración es el paso más importante. El tiempo debe ser suficiente para que deje de desprenderse cristal violeta de la preparación sin decolorarla completamente). Cuando se añade etanol a una mezcla de células Gram positivas y Gram negativas teñidas con cristal violeta, las células Gram positivas quedan teñidas de violeta: no puede atravesar la gruesa capa de mureína o peptidoglicano (pueden hacerlo si se prolonga excesivamente el contacto con el alcohol). La pared de las bacterias Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína más delgada, a través de la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas células. Su citoplasma queda incoloro y puede teñirse de color rosa con el colorante de contraste: la safranina.
- que el laboratorio de hoy fue aplasado y se realiza la proxima semana con el cultivo de B. cereus que tiene 9 días de antigüedad. Al
realizar la tinción de Gram usted observa celular teñidas de violeta intenso y otras de color rosa. Proponga una explicación a este reultado. R// Bacillus cereus es una bacteria Gram-positiva, que normalmente se tiñe de violeta debido a la retención del cristal violeta-iodo en su gruesa capa de peptidoglicano, con el envejecimiento del cultivo, algunas células pueden experimentar cambios en su pared celular, incluyendo la degradación o el daño de la capa de peptidoglicano, lo que puede resultar en una menor retención del cristal violeta REFRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. María J. Casasola. La importancia de realizar una correcta tinción de Gram en la identificación bacteriana. Revista microbiólogos. 29/o8/2022. https://revista.microbiologos.cr/wp- content/uploads/2022/08/Volumen- 27 - N%C2%BA2-Arti%CC%81culo- 3 - 89 - 98.pdf M. C. Laura A. Sánchez. Estudio microscópico de microorganismos. Facultad de ciencias UAEM. 2017. http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500. 799/70467/secme-29089_1.pdf?sequence=
Incube las cajas de Petri a 37°C durante 24 a 48 horas, colocándolas en forma invertida para evitar que el agua de condensación caiga sobre el cultivo.
- Cultivo en tubos con caldo nutritivo: siembre un cultivo puro de la cepa asignada por el profesor de la siguiente manera: Tome el tubo que contiene el cultivo puro, retire la tapa del tubo y flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en el tubo sin tocar las paredes y tome un poco del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido
- Cultivo en tubos con agar inclinado: Procede de la misma forma que en la siembra anterior pero con la aguja de inoculación realice una punción y estríe en el plano inclinado.
ANTES DE LA INCUBACIÓN
Figura 1. Muestra de caja Petri Bacillus Cereus antes de incubación Figura 2. Imagen lateral con nombre de la bacteria utilizada. Klebicella.
RESULTADOS.
Figura 3. Imagen de las dos muestras de medio de cultivo. 1 (bacteria Klebicella), 2 (bacteria bacillus cerreus) Figura 4. Cultivo en tubo con caldo nutritivo antes incubación. Figura 1. Resultado de la incubación de la bacteria bacillus cereus. No se observó cultivo de la bacteria. Figura 2. Resultado de la incubación de la bacteria Klebicella. Vemos un cultivo y crecimiento considerable de la bacteria. (^1 )
Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo E. coli S. aureus muestra problema Tubos inclinados de agar nutritivo No se hizo en tubo inclinado Crecimiento (^) No se hizo en tubo inclinado cultivo en Tubos con caldo Bacteria bacillus cereus Crecimiento: Elevado (1cm) color: Blanco levemente amarillento TABLA 2. Características del cultivo en tubo DISCUSIÓN Durante el cultivo de la bacteria bacillus cereus en la caja Petri se observó visiblemente una adherencia a la superficie de esta, mostrando a la luz el frotis, sin embargo, como vimos en resultados esta bacteria no tuvo crecimiento en cultivo del medio sólido, suponemos que posiblemente haya sido por el tiempo que estuvo incubada, aproximadamente mas de una semana, que posiblemente hizo que posiblemente entrara en una “fase estacionaria” donde las condiciones por causa del tiempo como lo es, por ejemplo, los nutrientes se agotan y los productos de desecho se acumulan haciendo que el crecimiento se ralentice. Lo que nos lleva a la conclusión que por causas de bajo conteo viable de los días haya sido la causa del invisible crecimiento de la bacteria. CONCLUSIÓNES
- Es importante mantener los utensilios con los cuales trabajaremos esterilizados adecuadamente, hablando más específicamente en un laboratorio; como sabemos, los medios de cultivo tienen como finalidad hacer crecer microorganismos para su posterior estudio, pero para que los microorganismos crezcan necesitan ciertos nutrientes.
- Dejar Bacillus cereus incubando por más de una semana puede llevar a un agotamiento de nutrientes y una acumulación de productos de desecho tóxicos, inhibiendo el crecimiento bacteriano.
- La técnica de cultivo de la muestra, establece patrones que permitan una mejor observación de bacterias, como la forma de colonia.
CONSULTA
¿Qué es el agar y de donde se obtiene? El agar es una sustancia formada de gel que se obtiene principalmente del alga marina Gelidium. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio general para el cultivo de bacterias? El agar es un medio general para el cultivo de bacterias pues estos microorganismos son incapaces de degradarlo, puesto que presenta una capacidad superior a la gelatina animal para resistir la capacidad licuadora de los microorganismos y mantenerse estables a una temperatura adecuada parala incubación de los mismos. Por otra parte, puede ser solidificado o convertido en gel con facilidad. ¿Cuáles son las ventajas de un cultivo puro? Las ventajas de un cultivo puro derivan principalmente a la razón de que contienen un solo tipo de microorganismo lo que facilita su estudio, así como también se aseguran los resultados reproducibles ya que mitiga variables que pueden afectar en su crecimiento, sin competencia de otras especies. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen? Los medios de cultivo donde vamos a crecer a los microorganismos deben de ser utilizados en condiciones asépticas para evitar su contaminación con los microorganismos presentes en el medio ambiente, el compartir el mechero implicaría dejar nuestro medio de cultivo expuesto a su contaminación. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia? Para esterilizar las partes donde posiblemente hubo contacto o puede ser una vía contaminación de un microrganismo que pueda afectar a nuestro medio de cultivo. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. Porque la boca del tubo es el área más expuesta a contaminación esto podría afectar a nuestro inoculo contaminando nuestro medio de cultivo. Cuando tomas un inóculo de una caja de Petri. ¿Por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? Estos nos ayudan a que nuestro inoculo de microrganismo le sea más fácil reconocer el medio al cual será expuesto permitiendo de esta manera bajo condiciones adecuadas su efectivo crecimiento. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? Para evitar posibles agentes contaminantes el cual pueda afectar el estudio de un microrganismo especifico alterando el resultado del estudio. ¿Por qué las cajas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación? Una de las razones por las cuales la tapa de placa Petri se mantiene invertida durante la incubación es para evitar la condensación de agua en el agar, adicional a esto facilita la inoculación de la bacteria, por otro lado, a estar invertida mitiga la posibilidad de que los contaminantes del ambiente afecten su crecimiento.
DISTRIBUCIÓN Y UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS
RESUMEN: Los microorganismos, en particular las bacterias, desempeñan roles cruciales en diversos ecosistemas y en la salud humana. En el laboratorio, se estudian bajo condiciones controladas para entender su comportamiento, necesidades nutricionales y mecanismos de interacción. Las bacterias requieren ambientes específicos con temperaturas, pH, y nutrientes adecuados para crecer óptimamente, lo que se proporciona mediante medios de cultivo especializados. Estos medios pueden ser selectivos o diferenciales para favorecer o identificar ciertas bacterias. En este laboratorio, en base a los medios de cultivo se tuvo en cuenta la esterilización para la precaución de posibles contaminantes, vemos aquí por medio de observaciones sus características físicas y las recomendaciones a tener en cuenta. Palabras Claves: microorganismos, bacterias, cultivo celular, medios de cultivo, esterilización ABSTRACT : Microorganisms, particularly bacteria, play crucial roles in diverse ecosystems and human health. In the laboratory, they are studied under controlled conditions to understand their behavior, nutritional needs, and interaction mechanisms. Bacteria require specific environments with adequate temperatures, pH, and nutrients to grow optimally, which is provided by specialized culture media. These means can be selective or differential in favoring or identifying certain bacteria. In this laboratory, based on the culture media, sterilization was taken into account for the precaution of possible contaminants, we see here through observations their physical characteristics and the recommendations to be taken into account. Key Words: microorganisms, bacteria, cell culture, culture media, sterilization
1. Introducción La esterilización es un aspecto crucial en la práctica de laboratorio para prevenir la contaminación cruzada y garantizar la validez de los experimentos. Las técnicas de esterilización incluyen el uso de autoclaves, que emplean vapor a alta presión para eliminar microorganismos, la filtración, que remueve partículas contaminantes de los líquidos, y el uso de lámparas de luz ultravioleta para desinfectar superficies y aire. Diferenciar bacterias en el laboratorio se logra mediante el uso de medios de cultivo especializados, técnicas de tinción como la tinción de Gram, y pruebas bioquímicas que identifican características específicas de las bacterias. La incubación es un paso fundamental en el cultivo de bacterias, ya que proporciona las condiciones óptimas de temperatura, humedad y tiempo necesarias para el crecimiento y la reproducción de los microorganismos. 2. Materiales y reactivos Materiales: 1. Cajas de Petri con agar nutritivo 2. Escobillón de algodón estéril 3. lncubadora 3. Metodología
- Muestras de la población bacteriana ambiental: Coloque una caja de Petri sobre cualquier lugar del laboratorio, destápela y déjela expuesta al medio ambiente durante 15 minutes. Después de este periodo tápela y márquela adecuadamente. Incube dejando la caja invertida a 37 °C de 24 a 48 horas.
- Bacterias en la superficie de la mesa de trabajo: Tome un escobillón y frótelo sobre la superficie de la mesa de trabajo, levante la tapa de la caja de Petri y aplique el escobillón sobre un extremo de la superficie de agar, hacienda luego estrías con el asa estéril según figura No. 1 (No rompa el agar). Tape la caja, inviértala y márquela adecuadamente, incube a 37°C por un tiempo de 24 a 48 horas.
- Microorganismos de mucosas y de piel: Con un escobillón estéril frótelo sobre cualquier parte de la superficie del cuerpo o insérteselo en la nariz o carrillo de la boca y frote suavemente la mucosa de la misma. Puede ser también un cabello, aliento, huella digital, etc. inocule una caja de agar nutritivo como lo hizo en el caso anterior. Tape la caja, inviértala adecuadamente, incube a 37 °C por un tiempo de 24 a 48 horas. RESPUESTAS A PREGUNTAS. Distintos tipos de medios de cultivo. Existen muchos tipos de cultivos hasta la actualidad, en los cuales tenemos: Figura 1. AGAR NUTRITIVO Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y de productos lácteos; también para el cultivo de la mayoría de microorganismos menos fastidiosos, de la misma manera para el transporte y conservación de cepas, para aislar organismos en cultivos puros y para el cultivo preliminar demuestras sometidas a exámenes de laboratorio. Figura 2. AGAR DE SANGRE Es un medio enriquecido que posee como principal componente a la sangre. Permite el crecimiento y aislamiento de microorganismos exigentes. También permite evidenciar la acción lítica de la hemolisina frente a los glóbulos rojos del medio. Figura 3. AGAR MONKEY Medio diferencial para guiar la identificación de Enterobacteriaceae fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. Se recomienda para la detección de escherichia coli en agua, alimentos, productos lácteos y preparados farmacéuticos. Figura 4. AGAR DE CHOCOLATE Este medio está compuesto por una base de agar rico en nutrientes y sangre calentada. La hemólisis de los glóbulos rojos proporciona al medio factor X (hemina) y factor V (NAD), necesarios para el crecimiento de algunos microorganismos, como el género Haemophilus. También es muy útil para el aislamiento de Neisserias sp. Preparación y esterilización de medios de cultivo. Condiciones generales del medio de cultivo: . disponibilidad de nutrientes adecuados : como carbono, nitrógeno, sales orgánicas, ciertas vitaminas, entre otras. . consistencia adecuada : según el tipo de bacteria a cultivar y aún, según el propósito del cultivo.
DISCUSIÓN
Importancia del buen manejo al realizar cultivos de microorganismos. Tomado de: Reduca. Autor: Blanca P. Isabel de S. Begoña T. Covandonga V. Una vez realizado el método, obtenido y analizado los resultado tanto de la elaboración de los medios de cultivos, la inoculación o siembra del agente del medio enriquecido mediante la técnica correcta, así como la recolección del agente para su observación y hacer una descripción del mismo rescatamos la importancia de cada uno de los procedimientos para que el resultado obtenido sea satisfactorio y que poniendo en práctica en un entorno donde se tenga que identificar el agente. Realizar correctamente estos pasos ayudará a que nuestros medios de cultivos sean óptimos para el desarrollo de los microorganismos que queremos inocular en ellos. Así mismo se debe tener presente la esterilización para dar buenas condiciones al medio de cultivo.
5. Conclusiones - La esterilización de medios de cultivo, equipos y superficies es esencial para evitar la contaminación cruzada y garantizar la validez de los resultados. - Los medios de cultivo son fundamentales para el crecimiento y estudio de microorganismos en laboratorios. Su composición precisa, que incluye nutrientes, pH y otros factores, es crucial para proporcionar un entorno óptimo que permita a los microorganismos desarrollarse y ser observados.
- se identificaron diferentes morfologías en los microorganismos de las muestras de forma adecuada, llegando así a un saber sobre estas. 6. Referencias Bibliográficas Blanca Pérez-Uz. M. Isabel de Silóniz. Begoña Torralba. Covadonga Vázquez. (2010). Metodología de esterilización en el laboratorio microbiológico. Reduca. file:///C:/Users/user/Downloads/818- 988 - 1 - PB.pdf Dra. Zoila del S. López Díaz. Dr. Michel García Tarrau. 09/19/2013. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN MATERIAL DE APOYO A LA DOCENCIA ASIGNATURA ESTERILIZACIÓN Y BIOSEGURIDAD PRIMER AÑO. Universidad virtual de Salud. http://uvsfajardo.sld.cu/tema- 7 - metodos-de-esterilizacion
SENSIBILIDAD BACTERIANA
INTRODUCCIÓN.
Los antibióticos son productos del metabolismo secundario de diversos microorganismos que participan en procesos ecológicos de competencia por nichos nutricionales y representan un ejemplo de diferenciación y especialización microbiana. Los microorganismos productores de antibióticos también posean mecanismos de resistencia a los mismos antibióticos que producen. Paralelamente, en esta competencia dinámica, otros microorganismos han desarrollado sus propios mecanismos de resistencia o los han adquirido directamente de los microorganismos productores de antibióticos. Como objetivos para esta práctica se tiene identificar la bacteria problema y determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de determinado microorganismo. MATERIALES
- Cajas de Petri con agar Muelller- Hinton o nutritivo
- Escobillón de algodón estéril
- lncubadora
- Cultivo de 24-48 horas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella spp en caldo nutritivo.
- Mechero
- Sensidiscos para antibiograma
- Marcador PROCEDIMIENTO
- Humedezca el escobillón en la suspensión de cultivo y quite el exceso de caldo presionando y girando el escobillón sobre la pared interna del recipiente, por arriba del nivel del caldo.
- Estrié el medio en tres o cuatro direcciones sobre la totalidad de la superficie del agar para obtener un inóculo uniforme y espere 3 a cuatro minutos que se seque el inóculo
- Tome una pinza estéril y coloque los sensidiscos en un tiempo menor a 15 minutos después de haber inoculado la caja, presione ligeramente los discos para asegurar un contacto con la superficie. Evite una sobreposición de las zonas de inhibición con una distribución adecuada de los discos y con un límite no menos de 15 cm de los bordes de la placa
- Invierte la cajas e incube el cultivo a 37 ˚C por 16 a 18 horas RESULTADOS Figura 1. Imagen del cultivo de las bacterias con los antibióticos presentes.
formación de enlaces cruzados en el peptidoglicano. Debilitamiento de la pared celular : La inhibición de la síntesis de peptidoglicano provoca que la pared celular bacteriana sea débil e inestable. Esto es particularmente perjudicial para las bacterias durante la división celular, ya que la pared celular no puede formarse correctamente, lo que lleva a una lisis celular. DISCUSIÓN “La introducción de los antibióticos en la práctica clínica supuso una de las intervenciones más importantes para el control de las enfermedades infecciosas. Los antibióticos han salvado millones de vidas, y además han supuesto una revolución en la medicina. Sin embargo, una amenaza creciente deteriora la eficacia de estos fármacos” (Juan-Ignacio Alós. Diciembre, 2015) Con este artículo queremos resaltar un tema que ha estado creciendo en la actualidad, con respecto a la resistencia de las bacterias a los antibióticos, en este laboratorio, vimos que en uno de los antibióticos no fue sensible al medicamento o aún el halo de inhibición de todos es considerablemente bajo. CONCLUSIONES.
- Las bacterias pueden desarrollar resistencia a los antibióticos
- El uso inadecuado y excesivo de antibióticos en medicina y agricultura contribuye significativamente al aumento de la resistencia bacteriana.
- La prueba de sensibilidad bacteriana es crucial para determinar el antibiótico más efectivo contra una bacteria específica. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Juan-Ignacio Alós, Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis global, Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Volume 33, Issue 10, 2015, Pages 692-699, ISSN 0213 - 005X, https://doi.org/10.1016/j.eimc.2014.10.004. (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S 0213005X14003413) Grayson Lindsay. Kucer¨s the use of antibiotics. 6edithion. 2010. https://www.facm.ucl.ac.be/Full-texts- FACM/Langan- 2010 - 1.pdf
