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Un ejercicio práctico de clonación del gen gh1 de homosapiens en el hospedero e.coli. Se detallan los pasos del proceso, desde la preparación del inserto y el vector hasta la transformación y selección de transformantes. Útil para estudiantes de biología molecular o genética que buscan comprender los principios de la clonación genética.
Tipo: Diapositivas
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Hormona de crecimiento 1 (GH1)
Codifica la hormona de crecimiento humano,
proteína para el crecimiento y desarrollo
corporal. Estimula el crecimiento de huesos y
tejidos, regula el metabolismo de proteínas,
grasas y promueve el desarrollo muscular y
óseo.
ETAPA 1: PREPARACIÓN DEL INSERTO
GGATCCGACAGCTCACCTAGCTGCAAatggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcct gctctgcctgccctggcttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacg ctatgctccgcgcccatcgtctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagtttgaagaagcctatat cccaaaggaacagaagtattcattcctgcagaacccccagacctccctctgtttctcagagtctattccg aaccctccaacagggaggaaacacaacagaatccaacctagagctgctccgcatctccctgctgctcatc cagtcgtggctggagcccgtgcagttcctaggagtgtcttcgccaacagcctggtgtacggcgcctctga cagcaacgtctatgacctcctaaaggacctagaggaaggcatccaaacgctgatggggaggctggaaga tggcagcccccggactgggcagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacacaaactacacaacgat gacgcactactcaagaactacgggctgctctactgcttcaggaaggacatgacaaggtcgagacattcc
CDS:653nt Enzimas de restricción: 12nt Primers:40nt En total son:705nt
3. Ligación
reacción pipeteando hacia arriba
y hacia abajo y microcentrífuga
ambiente a 25°C durante 15-
minutos.
inactivación con calor reduce
drásticamente la
eficiencia de la transformación
4. Transformación
-ELECTROPORACIÓN
Procedimiento Preparación de células y ADN: •Mantén las células electrocompetentes y el ADN en hielo durante todo el proceso. •Descongela un tubo de células en hielo (normalmente 50–100 μl por reacción). 2.Mezcla de ADN y células: •Añade 1–2 μl de ADN plasmídico (aproximadamente 10–50 ng) a las células descongeladas. •Mezcla suavemente sin agitar. Mantén la mezcla en hielo. 3.Preparación de la cubeta de electroporación: •Asegúrate de que la cubeta esté fría (puedes mantenerla en hielo antes de usarla). •Pipetea la mezcla de células y ADN (~50 μl) directamente en la cubeta, evitando burbujas. •Limpia cualquier humedad externa de la cubeta con un papel absorbente. 4.Electroporación: •Coloca la cubeta en el electroporador. •Aplica el pulso eléctrico con los siguientes parámetros: •Voltaje: 1.8–2.5 kV (dependiendo de las células y la cubeta).
•Tiempo de pulso: 4–5 ms. •Campo eléctrico: 12.5 kV/cm para cubetas de 2 mm (ajustar para otras cubetas). •Escucha un “chirrido” que confirma la descarga eléctrica. 5.Recuperación: •Inmediatamente después del pulso, añade 950 μl de medio SOC estéril a la cubeta. •Transfiere el contenido a un tubo estéril de cultivo. •Incuba a 37 °C durante 1 hora con agitación (250 rpm) para permitir la recuperación y expresión del gen de resistencia. 6.Selección en placas: •Realiza diluciones en serie (si es necesario) y siembra 50–100 μl en placas de agar con el antibiótico adecuado. •Incuba las placas a 37 °C durante 12–16 horas. 7.Análisis de resultados: •Verifica la presencia de colonias en las placas al día siguiente.
6.Selección de transformantes