Clonación del Gen GH1 de Homosapiens en el Hospedero E.Coli - Prof. Linares, Diapositivas de Ingeniería Genética

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CLONACIÓN DEL GEN GH1 DE

HOMOSAPIENS EN EL HOSPEDERO

E.COLI

Integrantes:

Maria Del Pilar Torres Perez

Mirelle Gamboa Soto

Karla Denisse Morante Méndez

Hormona de crecimiento 1 (GH1)

Codifica la hormona de crecimiento humano,

proteína para el crecimiento y desarrollo

corporal. Estimula el crecimiento de huesos y

tejidos, regula el metabolismo de proteínas,

grasas y promueve el desarrollo muscular y

óseo.

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000515.
• Inicio del ORF: 64 Fin del ORF:
• CODÓN:ATG posición 64-
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_

Primer sentido

5´-GGATCCGACAGCTCACCTAGCTGCAA-3´

5´-GGATCCGACAGCTCACCTAGCTGCAA ATGACGAACGACAGTCTCCGGGATCC-5´

3´-CCTAGGCTGACGAGTGGATCGACGTT TAGACGTTGCTGTCAGAGGCCCTAGG-5´

3´-TAGACGTTGCTGTCAGAGGCCCTAGG-5´

Primer antisentido

RT-PCR

BamHl Smal

5´-GGATCCGACAGCTCACCTAGCTGCAA ATGACGAACGACAGTCTCCGGGATCC-5´

3´-CCTAGGCTGACGAGTGGATCGACGTT TAGACGTTGCTGTCAGAGGCCCTAGG-5´

GH1 GENE

ETAPA 1: PREPARACIÓN DEL INSERTO

GH1 GENE

GGATCCGACAGCTCACCTAGCTGCAAatggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcct gctctgcctgccctggcttcaagagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacg ctatgctccgcgcccatcgtctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagtttgaagaagcctatat cccaaaggaacagaagtattcattcctgcagaacccccagacctccctctgtttctcagagtctattccg aaccctccaacagggaggaaacacaacagaatccaacctagagctgctccgcatctccctgctgctcatc cagtcgtggctggagcccgtgcagttcctaggagtgtcttcgccaacagcctggtgtacggcgcctctga cagcaacgtctatgacctcctaaaggacctagaggaaggcatccaaacgctgatggggaggctggaaga tggcagcccccggactgggcagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacacaaactacacaacgat gacgcactactcaagaactacgggctgctctactgcttcaggaaggacatgacaaggtcgagacattcc

tgcgcatcgtgcagtgccgctctgtggagggcagctgtggcttctagTAGACGTTGCTGTCAGAGGC

CCTAGG

CDS:653nt Enzimas de restricción: 12nt Primers:40nt En total son:705nt

3. Ligación

1. Se mezcla suavemente la

reacción pipeteando hacia arriba

y hacia abajo y microcentrífuga

2. Incubar a temperatura

ambiente a 25°C durante 15-

minutos.

3. Enfríe en hielo y transforme
4. No inactivar con calor: la

inactivación con calor reduce

drásticamente la

eficiencia de la transformación

4. Transformación

-ELECTROPORACIÓN

Procedimiento Preparación de células y ADN: •Mantén las células electrocompetentes y el ADN en hielo durante todo el proceso. •Descongela un tubo de células en hielo (normalmente 50–100 μl por reacción). 2.Mezcla de ADN y células: •Añade 1–2 μl de ADN plasmídico (aproximadamente 10–50 ng) a las células descongeladas. •Mezcla suavemente sin agitar. Mantén la mezcla en hielo. 3.Preparación de la cubeta de electroporación: •Asegúrate de que la cubeta esté fría (puedes mantenerla en hielo antes de usarla). •Pipetea la mezcla de células y ADN (~50 μl) directamente en la cubeta, evitando burbujas. •Limpia cualquier humedad externa de la cubeta con un papel absorbente. 4.Electroporación: •Coloca la cubeta en el electroporador. •Aplica el pulso eléctrico con los siguientes parámetros: •Voltaje: 1.8–2.5 kV (dependiendo de las células y la cubeta).

•Tiempo de pulso: 4–5 ms. •Campo eléctrico: 12.5 kV/cm para cubetas de 2 mm (ajustar para otras cubetas). •Escucha un “chirrido” que confirma la descarga eléctrica. 5.Recuperación: •Inmediatamente después del pulso, añade 950 μl de medio SOC estéril a la cubeta. •Transfiere el contenido a un tubo estéril de cultivo. •Incuba a 37 °C durante 1 hora con agitación (250 rpm) para permitir la recuperación y expresión del gen de resistencia. 6.Selección en placas: •Realiza diluciones en serie (si es necesario) y siembra 50–100 μl en placas de agar con el antibiótico adecuado. •Incuba las placas a 37 °C durante 12–16 horas. 7.Análisis de resultados: •Verifica la presencia de colonias en las placas al día siguiente.

6.Selección de transformantes

● MEDIO CON KANAMICINA

● La Kanamicina selecciona las bacterias que

mantienen el vector pFN2K, ya que este

confiere resistencia al antibiótico.