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76 SECCIÓN I Estructuras y funciones de proteínas y enzimas
LAS ECUACIONES
DE MICHAELISMENTEN Y DE HILL
MODELAN LOS EFECTOS DE LA
CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
La ecuación de Michaelis-Menten
La ecuación de Michaelis-Menten (29) ilustra en términos ma- temáticos la relación entre la velocidad de reacción inicial vi y la concentración de sustrato [S], que se muestra de manera gráfica en la figura 8-4:
v
S S
i m
=
[ ]
+ [ ]
V K
máx (29)
La constante Km de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual vi es la mitad de la velocidad máxima (Vmáx/2) alcan- zable a una concentración particular de enzima. De este modo, Km tiene las dimensiones de la concentración de sustrato. La dependencia de la velocidad de reacción inicial de [S] y Km puede ilustrarse al evaluar la ecuación de Michaelis-Menten en tres condiciones.
1. Cuando [S] es mucho menor que Km (punto A en las fi- guras 8-4 y 8-5), el término Km + [S] es en esencia igual a la Km. El remplazo de Km + [S] con Km reduce la ecuación (29) a
v
S S
v
S i S m
i m m
=
[ ]
+ [ ]
≈
[ ]
≈
[ ]
V K
V K
V K
máx máx máx (30)
donde ≈ significa “aproximadamente igual a”. Dado que tanto Vmáx como Km son constantes, su proporción es una constante. En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de Km, vi es proporcional a k[S]. Por ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].
2. Cuando [S] es mucho mayor que Km (punto C en las figu- ras 8-4 y 8-5), el término Km + [S] es en esencia igual a [S]. Re- emplazar Km + [S] por [S] reduce la ecuación (29) a
v
S S
v
S S
i m
= (^) i
[ ]
+ [ ]
≈
[ ]
[ ]
≈
V K
V máx máx Vmáx (31)
De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad de reacción es máxima (Vmáx) y no está afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato.
3. Cuando [S] = Km (punto B en las figuras 8-4 y 8-5):
v
S S
S i m S =
[ ]
+ [ ]
=
[ ]
[ ]
=
V K
máx V^ máx Vmáx 2 2
La ecuación (32) declara que cuando [S] es igual a Km, la veloci- dad inicial es de la mitad del máximo. La ecuación (32) también revela que Km es —y puede determinarse la manera experimen- tal a partir de— la concentración de sustrato a la cual la veloci- dad inicial es de la mitad del máximo.
Una forma lineal de la ecuación
de Michaelis-Menten se usa
para determinar Km y Vmáx
La medición directa del valor numérico de Vmáx, y, por consi- guiente, el cálculo de Km, a menudo requiere concentraciones
altas poco prácticas de sustrato para alcanzar condiciones de sa- turación. Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten evita esta dificultad y permite extrapolar Vmáx y Km desde datos de velocidad inicial obtenidos a concentraciones de sustrato me- nores que las que producen saturación. Se empieza con la ecua- ción (29),
v
S S
i m
=
[ ]
+ [ ]
V K
máx (29)
se invierte 1 v
S
i S
= m+^ [ ]
[ ]
K Vmáx
se factoriza 1 v S
S
i S
= m
[ ]
[ ]
[ ]
K Vmáx Vmáax
y se simplifica 1 v S
1
i
= m
[ ]
K Vmáx Vmáx
1 (35)
La ecuación (35) es la ecuación para una línea recta y = ax + b, donde y = 1/vi y x = 1/[S]. Un gráfico de 1/vi en el eje y, expre- sado como una función de 1/[S] en el eje x, da una línea recta cuya intersección en el eje y se define como 1/Vmáx y la pendien- te se define como Km/Vmáx. Ese gráfico se conoce como gráfico del doble recíproco o de Lineweaver-Burk ( figura 8-6 ). Esta- blecer el término y de la ecuación (36) igual a cero y resolver para x, revela que la intersección x es –1/Km.
0
1 = a b por lo tanto, = =
b a (^) m
x + x
− − ; K
De este modo, Km se calcula con mayor facilidad a partir de la intersección x negativa. La mayor virtud del gráfico de Lineweaver-Burk reside en la facilidad con la cual puede usarse para determinar los mecanis- mos cinéticos de inhibidores de enzima (véase más adelante). Sin embargo, al usar un gráfico del doble recíproco para determinar constantes cinéticas, es importante evitar la introducción de ses- go por la agrupación de datos a valores bajos de 1/[S]. Para evi- tar el sesgo, se prepara una solución de sustrato cuya dilución hacia una valoración producirá la concentración deseada máxi- ma de sustrato. Ahora se utiliza el mismo volumen de soluciones preparadas al diluir la solución madre por factores de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, etc. Los datos entonces caerán en el eje 1/[S] a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, etc. De manera alternativa, para minimizar la
[S]
1
K m
-^1
v i
1
V máx
1
V máx Pendiente =^ K m
0
FIGURA 8!6 Gráfico del doble recíproco o de Lineweaver-Burk
de 1/vi en contraposición con 1/[S] usado para evaluar la Km y Vmáx.
CAPÍTULO 8 Enzimas: cinética 77
agrupación puede usarse un gráfico del recíproco único, como el de Eadie-Hofstee (vi contra vi/[S]) o de Hanes-Woolf ([S]/vi contra [S]).
La constante catalítica, kcat
Es factible usar varios parámetros para comparar la actividad relativa de diferentes enzimas o de distintas preparaciones de la misma enzima. La actividad de preparaciones de enzima impuras por lo general se expresa como actividad específica (Vmáx dividida por la concentración de proteína). Para una en- zima homogénea es posible calcular su número de recambio (Vmáx dividida por los mol de enzima presentes). Sin embargo, si se conoce el número de sitios activos presentes, la actividad catalítica de una enzima homogénea se expresa mejor como su constante catalítica, kcat (Vmáx dividida por el número de sitios activos, St).
k
V cat
máx St
Dado que las unidades de concentración se anulan, las unidades de kcat son tiempo recíproco.
Eficiencia catalítica, kcat/Km
¿Mediante qué medida se deben cuantificar y comparar la efi- ciencia de enzimas diferentes, sustratos diferentes para una en- zima dada, y la eficiencia con la cual una enzima cataliza una reacción en las direcciones hacia adelante y hacia atrás? Si bien la capacidad máxima de una enzima dada para convertir sustra- to en producto es importante, los beneficios de una kcat alta sólo pueden obtenerse si la Km es suficientemente baja. De este modo, la eficiencia catalítica de enzimas se expresa mejor en términos de la proporción de estas dos constantes cinéticas, kcat/Km.
Para ciertas enzimas, una vez que el sustrato se une al sitio activo, se convierte en producto y se libera con tanta rapidez como para hacer a estos eventos efectivamente instantáneos. Para estos catalíticos tan eficientes, el paso limitante es la forma- ción del complejo ES. Se dice que esas enzimas están limitadas por difusión, o que son perfectas desde el punto de vista catalí- tico, puesto que el índice de catálisis más rápido posible está determinado por el índice al cual las moléculas se mueven o di- funden a través de la solución. Los ejemplos de enzimas para las cuales kcat/Km se aproxima al límite de difusión de 10^8 a 10^9 M–1s–1^ incluyen la triosafosfato isomerasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa. En células vivas, el montaje de enzimas que catalizan reac- ciones sucesivas hacia complejos multiméricos puede evitar las limitaciones impuestas por la difusión. Las relaciones geomé- tricas de las enzimas en estos complejos son tales que los sustra- tos y productos no se difunden hacia la solución de volumen sino hasta que se completa el último paso de la secuencia de pasos catalíticos. La ácido graso sintetasa extiende este concep- to un paso más allá al fijar de manera covalente la cadena de ácido graso sustrato en crecimiento a una cadena de biotina que rota de un sitio activo a otro dentro del complejo hasta que se completa la síntesis de una molécula de ácido palmítico (cap. 23).
La Km puede aproximar una constante de unión La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de la constante de disociación Kd para la disociación del complejo de enzima-sustrato ES.
E S ES
k
1 1
Kd
k k
=
− 1 1
Dicho de otra manera, mientras menor es la tendencia a diso- ciarse de la enzima y su sustrato, mayor es la afinidad de la en- zima por su sustrato. Si bien la constante de Michaelis Km a menudo aproxima la constante de disociación Kd, esto de nin- gún modo siempre es así. Para una reacción catalizada por enzi- ma típica,
E S ES E P
k k
1 1
el valor de [S] que da vi = Vmáx/2 es
S
k k k m
[ ] =^
− (^1 2) = 1
K (41)
Cuando k–1 ≫ k 2 , entonces
k (^) − 1 + k 2 ≈k− 1 (42)
y
S
k k
[ ] ≈^ = d −
1 1
K (43)
Por ende, 1/Km sólo aproxima 1/Kd en condiciones en las cuales la asociación y disociación del complejo ES son rápidas en com- paración con la catálisis. Para las muchas reacciones catalizadas por enzima para las cuales k–1 + k 2 no es aproximadamente igual a k–1, 1/Km subestimará 1/Kd.
La ecuación de Hill describe la conducta de enzimas que muestran unión cooperativa de sustrato Si bien casi todas las enzimas despliegan la cinética de satura- ción simple descrita en la figura 8-4, y se describen de manera adecuada mediante la expresión de Michaelis-Menten, algunas se unen a sus sustratos de una manera cooperativa , análoga a la unión de oxígeno por la hemoglobina (cap. 6). La conducta coo- perativa es una propiedad exclusiva de enzimas multiméricas que unen sustrato en múltiples sitios. Para enzimas que despliegan cooperación positiva en la unión de sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en vi con los cambios en [S] es sigmoidea ( figura 8-7 ). Ni la ex- presión de Michaelis-Menten ni sus gráficos derivados pueden usarse para evaluar cinética cooperativa. Por ende, los enzimó- logos emplean una representación gráfica de la ecuación de Hill que en su origen fue obtenida para describir la unión coopera- tiva de O 2 por la hemoglobina. La ecuación (44) representa la
CAPÍTULO 8 Enzimas: cinética 79
deshidrogenación. La formación y disociación del complejo EI es un proceso dinámico descrito por
E I E + I
k k − →^1 ← (^) − 1 ^ (45)
para la cual la constante de equilibrio Ki es
Ki i i
=
[ ][ ] [ −]
= −
E I
E I
k k
En efecto, un inhibidor competitivo actúa al disminuir el nú- mero de moléculas de enzima libres disponibles para unión a sustrato, esto es, para formar ES y, así, finalmente para for- mar producto , como se describe a continuación:
I
Un inhibidor competitivo y sustrato ejercen efectos recíprocos sobre la concentración de los complejos EI y ES. Dado que la formación de complejos ES elimina enzima libre disponible para combinarse con el inhibidor, el aumento de [S] disminuye la concentración del complejo EI y aumenta la velocidad de re- acción. El grado al cual [S] debe aumentarse para superar por com- pleto la inhibición depende de la concentración del inhibidor presente, su afinidad por la enzima, Ki, y la afinidad, Km, de la enzima por su sustrato.
Los gráficos del doble
recíproco facilitan
la evaluación de inhibidores
Los gráficos del doble recíproco distinguen entre inhibidores competitivos y no competitivos, y simplifican la evaluación de constantes de inhibición. vi se determina a varias concen- traciones de sustrato tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Para la inhibición competitiva clásica, las líneas que conectan los puntos experimentales convergen en el eje y ( figu- ra 8-10 ). Dado que la intersección y es igual a 1/Vmáx, este mode- lo indica que cuando 1/[S] se aproxima a 0, vi es independiente
de la presencia de inhibidor. Sin embargo, note que la intersec- ción en el eje x no varía con la concentración del inhibidor y que puesto que –1/K'm es de menor tamaño que 1/Km, K'm (la “Km aparente”), se hace más grande en presencia de concentraciones cada vez mayores del inhibidor. De este modo, un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre Vmáx pero aumenta K'm, la Km aparente para el sustrato. Para la inhibición competitiva simple, la intersección en el eje x es
x =
−
[ ]
1 1 K (^) m Ki
I (47)
Una vez que Km se ha determinado en ausencia de inhibidor, Ki puede calcularse a partir de la ecuación (47). Los valores de Ki se usan para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima. Mientras más bajo es el valor para Ki, más eficaz es el inhibidor. Por ejemplo, los fármacos estatina que actúan como inhibidores competitivos de la HMG-CoA reductasa (cap. 26) tienen valores de Ki de varios órdenes de magnitud más bajos que la Km para el sustrato HMG-CoA.
Los inhibidores no competitivos simples disminuyen Vmáx pero no afectan Km En la inhibición no competitiva estricta, la unión del inhibidor no afecta la unión de sustrato; por ende, es factible la forma- ción de complejos tanto EI como EIS. Sin embargo, si bien el complejo inhibidor de enzima aún puede unirse a sustrato, su eficiencia para transformar sustrato en producto, reflejada por Vmáx, está disminuida. Los inhibidores no competitivos unen enzimas en sitios distintos del sitio de unión a sustrato y por lo general muestran poca o ninguna semejanza estructural con el sustrato. Para la inhibición no competitiva simple, E y EI poseen afi- nidad idéntica por el sustrato, y el complejo EIS genera produc- to a un índice insignificante ( figura 8-11 ). La inhibición no competitiva más compleja ocurre cuando la unión del inhibidor afecta la afinidad aparente de la enzima por el sustrato, lo que hace que las líneas se intersequen en el tercer o cuarto cuadrante de un gráfico del doble recíproco (que no se muestra). Si bien ciertos inhibidores muestran características de una mezcla de inhibición competitiva y no competitiva, su evaluación va más allá del objetivo de este capítulo.
[S]
1
K m
-^1^ K ′m -^1
v (^) i
1
V máx
1
0
FIGURA 810 Gráfico de Lineweaver-Burk de inhibición
competitiva simple. Note la completa distensión de inhibición a [S] alta (esto es, 1/[S] baja).
v
No inhibidor V máx
máx
FIGURA 811 Gráfico de Lineweaver-Burk para inhibición no
competitiva simple.
80 SECCIÓN I Estructuras y funciones de proteínas y enzimas
Gráfico de Dixon
A veces se emplea como una alternativa para el gráfico de Li- neweaver-Burk, para determinar constantes de inhibición. La velocidad inicial (vi) se mide a varias concentraciones de inhi- bidor, pero a una concentración fija de sustrato (S). Para un inhibidor competitivo o no competitivo simple, un gráfico de 1/vi contra la concentración del inhibidor [I] da una línea recta. El experimento se repite a diferentes concentraciones fijas de sus- tratos. El conjunto de líneas resultantes interseca a la izquierda del eje y. Para inhibición competitiva, una perpendicular trazada hacia el eje x desde el punto de intersección de las líneas da –Ki ( figura 18-12 , arriba). Para inhibición no competitiva la inter- sección del eje x es –Ki ( figura 8-12 , abajo). En las publicaciones farmacéuticas a menudo se emplean gráficos de Dixon para ilus- trar la potencia comparativa de inhibidores competitivos.
IC 50
Una alternativa menos rigurosa, para Ki como una medida de la potencia inhibidora es la concentración de inhibidor que pro- duce inhibición de 50%, IC 50. Al contrario de la constante de disociación de equilibrio Ki, el valor numérico de IC 50 varía en función de las circunstancias específicas de la concentración de sustratos, etc., bajo la cual se determina.
Inhibidores estrechamente unidos
Algunos inhibidores se unen a enzimas con afinidad tan alta, Ki ≤10–9^ M, que la concentración de inhibidor requerida para medir Ki cae por debajo de la concentración de enzima típica- mente presente en una valoración. En estas circunstancias, una fracción importante del inhibidor total puede estar presente como un complejo EI. De ser así, esto viola la suposición, implí- cita en cinética de estado estable clásica, de que la concentración de inhibidor libre es independiente de la concentración de enzima.
El análisis cinético de estos inhibidores muy unidos requie- re ecuaciones cinéticas especializadas que incorporan la con- centración de enzima para estimar Ki o IC 50 , y para distinguir entre inhibidores competitivos y no competitivos estrechamente unidos.
Los inhibidores irreversibles
“envenenan” enzimas
En los ejemplos anteriores, los inhibidores forman un comple- jo disociable, dinámico, con la enzima; por ende, la enzima por completo activa puede recuperarse con tan sólo eliminar el inhibidor del medio circundante. Sin embargo, varios otros inhi- bidores actúan de manera irreversible al producir modificación química de la enzima. Estas modificaciones por lo general com- prenden hacer o romper enlaces covalentes con residuos amino- acilo esenciales para la unión a sustrato, catálisis o mantenimiento de la conformación funcional de la enzima. Dado que estos cam- bios covalentes son hasta cierto punto estables, una enzima que ha sido “envenenada” por un inhibidor irreversible, como un áto- mo de metal pesado o un reactivo acilante, permanece inhibida incluso después de eliminar del medio circundante el inhibidor que resta.
Inhibición basada en mecanismo
Los inhibidores “basados en mecanismo” o “suicidas” son análo- gos de sustrato especializados que contienen un grupo químico que puede transformarse mediante la maquinaria catalítica de la enzima blanco. Después de la unión al sitio activo, la catálisis por la enzima genera un grupo muy reactivo que forma un enla- ce covalente con un residuo esencial desde el punto de vista catalítico, y bloquea la función del mismo. La especificidad y la persistencia de inhibidores suicidas, que son tanto específicos para enzima como no reactivos fuera de los confines del sitio activo de la enzima, los hacen promisorios para la creación de fármacos específicos para enzima. El análisis cinético de inhibi- dores suicidas está más allá del objetivo de este capítulo. Ni el método de Lineweaver-Burk ni el de Dixon son aplicables por- que los inhibidores suicidas violan una condición limítrofe clave común a ambos métodos, a saber, que la actividad de la enzima no disminuye en el transcurso de la valoración.
CASI TODAS LAS REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMA
COMPRENDEN DOS O MÁS
SUSTRATOS
Si bien muchas enzimas tienen un sustrato único, muchas otras tienen dos —y a veces más— sustratos y productos. Los princi- pios fundamentales, antes comentados, si bien se ilustran para enzimas con un sustrato único, también aplican a enzimas con múltiples sustratos. Sin embargo, las expresiones matemáticas utilizadas para evaluar reacciones de múltiples sustratos son complejas. Aun cuando un análisis detallado del rango comple- to de reacciones de múltiples sustratos va más allá del objetivo de este capítulo, a continuación se consideran algunos aspectos
v (^) i
1
[I]
[S]
v (^) i
1
[S]
FIGURA 812 Aplicaciones de los gráficos de Dixon. Arriba:
inhibición competitiva, estimación de Ki. Abajo: inhibición no competitiva, estimación de Ki.
82 SECCIÓN I Estructuras y funciones de proteínas y enzimas
EL CONOCIMIENTO
DE LA CINÉTICA, EL MECANISMO
Y LA INHIBICIÓN DE ENZIMAS,
AYUDA A LA CREACIÓN
DE FÁRMACOS
Muchos fármacos actúan
como inhibidores de enzimas
El objetivo de la farmacología es identificar agentes que pueden
1. Destruir o alterar el crecimiento, la invasividad o el desa- rrollo de agentes patógenos invasores. 2. Estimular mecanismos de defensa endógenos. 3. Suspender u obstaculizar procesos moleculares aberrantes desencadenados por estímulos genéticos, ambientales o bio- lógicos, con perturbación mínima de las funciones celula- res normales del huésped. En virtud de sus diversas funciones fisiológicas y alto grado de selectividad de sustrato, las enzimas constituyen blancos natu- rales para la creación de fármacos que son tanto potentes como específicos. Los fármacos estatina, por ejemplo, disminuyen la producción de colesterol al inhibir la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (cap. 26), mientras que la emtricitabina y el tenofovir disoproxil fumarato bloquean la replicación del HIV al inhibir una inverso transcriptasa viral (cap. 34). La farmaco- terapia de la hipertensión a menudo incluye la administración de un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, lo que disminuye la concentración de angiotensina II, un vaso- constrictor (cap. 42).
La cinética enzimática define
condiciones de investigación apropiadas
La cinética enzimática tiene un papel crucial en el descubri- miento de fármacos. El conocimiento de la conducta cinética de la enzima de interés se necesita, ante todo, para seleccionar con- diciones de valoración apropiadas que detectan con facilidad la presencia de un inhibidor. La concentración de sustrato, por ejemplo, debe ajustarse de modo que se genere suficiente pro- ducto para permitir la detección fácil de actividad de la enzima sin que sea tan alta que enmascare la presencia de un inhibidor. En segundo lugar, la cinética enzimática proporciona el medio para cuantificar y comparar la potencia de diferentes inhibido- res y definir su modo de acción. Los inhibidores no competiti- vos son en particular deseables, porque —en contraste con los competitivos— sus efectos nunca pueden superarse por comple- to mediante incrementos de la concentración de sustrato.
La mayoría de los fármacos
se metabolizan in vivo
La creación de fármacos a menudo comprende más que la eva- luación cinética de la interacción de inhibidores con la enzima blanco. Enzimas presentes en el paciente o en el agente patógeno actúan sobre fármacos, proceso llamado metabolismo de fár- maco. Por ejemplo, la penicilina y otros antibióticos β-lactámicos bloquean la síntesis de la pared celular en bacterias al envenenar
de manera irreversible la enzima alanil alanina carboxipepti- dasa-transpeptidasa. Sin embargo, muchas bacterias producen β-lactamasas que hidrolizan la función β-lactámica crucial en la penicilina y fármacos relacionados. Una estrategia para supe- rar la resistencia a antibiótico resultante es administrar de ma- nera simultánea un inhibidor de β-lactamasa y un antibiótico β-lactámico. También se requiere a veces de transformación metabóli- ca para convertir un precursor farmacológico inactivo, o pro- fármaco , en su forma biológicamente activa (cap. 53). El ácido 2'-desoxi-5-fluorouridílico, un potente inhibidor de la timidi- lato sintasa, un blanco común de la quimioterapia de cáncer, se produce a partir de 5-fluorouracilo por medio de una serie de transformaciones enzimáticas catalizadas por una fosforribo- sil transferasa y las enzimas de la vía de salvamento de desoxirri- bonucleósido (cap. 33). El diseño y la administración eficaces de profármacos requieren conocimiento de la cinética y de los me- canismos de las enzimas encargadas de transformarlos en sus formas biológicamente activas.
RESUMEN
■ (^) El estudio de la cinética enzimática —los factores que afectan los índices de reacciones catalizadas por enzima— revela los pasos individuales mediante los que las enzimas transforman sustratos en productos. ■ (^) La ΔG, el cambio general de la energía libre para una reacción, es independiente del mecanismo de reacción, y no proporciona información respecto a los índices de reacciones. ■ (^) La Keq es una proporción de constantes de índice de reacción, se calcula a partir de las concentraciones de sustratos y productos en equilibrio, o a partir de la proporción k 1 /k–1. Las enzimas no afectan la Keq. ■ Las reacciones proceden por medio de estados de transición en los cuales ΔGF es la energía de activación. La temperatura, la concentración de ion hidrógeno, la concentración de enzima, la concentración de sustrato, y los inhibidores, afectan los índices de reacciones catalizadas por enzima. ■ (^) En la medición del índice de una reacción catalizada por enzima por lo general se emplean condiciones de índice iniciales, para las cuales la ausencia virtual de producto impide la reacción inversa. ■ (^) Las formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten simplifican la determinación de Km y Vmáx. ■ (^) Una forma lineal de la ecuación de Hill se usa para evaluar la cinética de unión a sustrato cooperativa mostrada por algunas enzimas multiméricas. La pendiente n, el coeficiente de Hill, refleja el número, la naturaleza y la fuerza de las interacciones de los sitios de unión a sustrato. Un valor de n de más de 1 indica cooperación positiva. ■ (^) Los efectos de inhibidores competitivos simples, que por lo general semejan sustratos, se superan al aumentar la concentración del sustrato. Los inhibidores no competitivos simples disminuyen la Vmáx pero no afectan la Km. ■ (^) Para inhibidores competitivos y no competitivos simples, la constante inhibitoria Ki es igual a la constante de disociación de equilibrio para el complejo de enzima-inhibidor relevante. Un término más simple y menos riguroso para evaluar la eficacia de un inhibidor es la IC 50 , la concentración del inhibidor que produce inhibición de 50% en las circunstancias particulares del experimento.
CAPÍTULO 8 Enzimas: cinética 83
■ (^) Los sustratos pueden añadirse en un orden al azar (cualquier sustrato puede combinarse primero con la enzima) y en un orden forzoso (el sustrato A debe unirse antes que el sustrato B). ■ (^) En reacciones de ping-pong, uno o más productos se liberan a partir de la enzima antes de que se hayan añadido todos los sustratos. ■ La cinética enzimática aplicada facilita la identificación y caracterización de fármacos que inhiben de manera selectiva enzimas específicas. De este modo, la cinética enzimática desempeña una función central y crucial en el descubrimiento de fármacos, en la farmacodinámica comparativa, y en la determinación del modo de acción de fármacos.
REFERENCIAS
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Cornish-Bowden A: Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press Ltd, 2004. Dixon M: The determination of enzyme inhibitor constants. Biochem J 1953;55:170. Dixon M: The graphical determination of Km and Ki. Biochem J 1972;129:197. Fersht A: Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. Freeman, 1999. Fraser CM, Rappuoli R: Application of microbial genomic science to advanced therapeutics. Annu Rev Med 2005;56:459. Henderson PJF: A linear equation that describes the steady-state kinetics of enzymes and subcellular particles interacting with tightly bound inhibitors. Biochem J 1972;127:321. Schramm, VL: Enzymatic transition-state theory and transition-state analogue design. J Biol Chem 2007;282:28297. Schultz AR: Enzyme Kinetics: From Diastase to Multi-enzyme Systems. Cambridge University Press, 1994. Segel IH: Enzyme Kinetics. Wiley Interscience, 1975. Wlodawer A: Rational approach to AIDS drug design through structural biology. Annu Rev Med 2002;53:595.
