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CLASE 1 – 27 de Enero de 2016
MEDICINA GENÓMICA
Genoma humano: Proyecto de secuenciación que se inicio a finales de los 80, el primer borrados se publico en el 2001. Secuenciación se refiere a conocer el orden de las bases nitrogenadas dentro de la molécula de material genético. El ser humano esta constituido por 3x10^9 pares de bases, es decir que una célula haploide esta constituida por 3.000 millones de pares de bases.
El 99% de nuestro genoma es idéntico, es decir que todos los seres humanos casi compartimos una misma identidad. Tan solo un 0.1% nos hace diferentes entre nosotros. Este porcentaje esta representado en una secuencia llamada SNP (Single NucleotidePolimorphism). Los SNP son variaciones en un solo nucleótido. Dentro de nuestra secuencia hay una variación de 1 solo nucleótido cada 1. nucleótidos. Hasta el momento se han encontrado 3.2 millones de variaciones (es decir, tenemos 3.2 millones de SNP diferentes).
Todos somos diferentes gracias a las variaciones en 1 solo nucleótido. Gracias a esto hay personas que son mas susceptibles a una enfermedad o a un medicamento.
Medicina genómica: Empleo sistemático de los análisis genéticos para mejorar el cuidado de la salud. Esta planteada para ser personalizada o individualizada, es decir, que se traten a los pacientes de acuerdo a sus condiciones genéticas particulares.
Las enfermedades no transmisibles (cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y respiratorias) son la mayor causa de muerte a nivel mundial. La OMS plantea: Disminuir los factores riesgo y buscar alternativas para el tratamiento de estas enfermedades. Entre estas alternativas esta la búsqueda de nuevos medicamentos, pero la idea es que los medicamentos tengan el menor numero de reacciones adversas y efectos colaterales.
Se fundamenta en:
- El entendimiento de las características biológicas de los individuos y el proceso salud- enfermedad (interacción dinámica entre los genes y el ambiente). Existen enfermedades que son de tipo hereditario y otras que son influenciadas por el ambiente, pero también hay enfermedades genéticas que se manifiestan de acuerdo al ambiente.
- SNP (Polimorfismo de nucleótido sencillo) 0.1%.
Objetivos:
- Integrar la genética con la medicina tradicional.
- Identificar genes candidatos para enfermedades multifactoriales comunes en la población. Genes candidatos se refiere a genes que están predispuestos a presentar
una enfermedad. Enfermedad multifactorial se refiere a que dicha enfermedad ha sido desencadenada por diferentes aspectos (genéticos, ambientales, etc.).
- Relacionar las interacciones entre los genes con modificadores ambientales, establecer pruebas diagnosticas para identificar individuos en situación de riesgo. Permite tomar decisiones con mas tiempo antes de que aparezca de manera agresiva la enfermedad.
- Promover una medicina mas preventiva y personalizada.
- Generar cambios en los comportamientos y habidos de las personas. Como el ambiente influye en la expresión de las enfermedades, al conocer con el perfil genético cuales pueden ser sus predisposiciones, fácilmente el medico puede orientar a cambios en el estilo de vida para que la enfermedad no aparezca o aparezca leve.
- Utilizar la terapia farmacológica acorde con el fenotipo de cada persona. No todos los medicamentos le sirven a todas las personas por igual.
Tipos:
1. Medicina personalizada o individualizada: Farmacogenomica: Se identifican los polimorfismos (variación, cambio. No siempre es malo, a veces es benéfico) que presentan las personas. En general estos polimorfismos están relacionados con aquellos genes que se involucran en el metabolismo de los medicamentos (CYP o citocromo P450). Cada uno de los genes se expresa para metabolizar cierto medicamento; hay metabolizadores lentos (el medicamento dura mas en su organismo) y rápidos (el medicamento es degradado rápido); sabiendo esto en cada persona se podrá determinar cual es la dosis y frecuencia de consumo adecuada para dicho paciente, y si el paciente es susceptible o no a presentar reacciones adversas. Toxicogenomica: Identifica aquellos elementos químicos, componentes de los alimentos y del amiente que pueden ser tóxicos para la célula, y por lo tanto que alteran el funcionamiento celular y molecular. Identificando los genes que se pueden alterar, se realizan tratamientos que reduzcan las alteraciones en ellos. Nutrigenomica: Se estudia como los micro y macronutrientes presentes en los alimentos pueden afectar el buen desarrollo celular. Estudia como los alimentos pueden predisponer a una persona a ciertas enfermedades. Hoy en día se puede hablar de nutrición personalizada. 2. Medicina predictiva: Utiliza los perfiles genéticos individuales para identificar cuales son las mutaciones que se pueden presentar y así comenzar a modificar en los pacientes los estilos de vida y los hábitos alimenticios para evitar la aparición de la enfermedad o disminuir los riesgos. 3. Medicina reproductiva: Fecundación in vitro, análisisgenético a los gametos antes de la fecundación para diagnostico de enfermedades, diagnostico genético pre- implantacional (al embrión se le hacen varias pruebas para diferentes enfermedades antes de realizar la implantación), técnicas de diagnostico pre-natal. 4. Medicina regenerativa: Reconstrucción de órganos y tejidos que hayan tenido alguna alteración. Comprende: Ingeniería de tejidos: A nivel in vitro se estimulan células madres para que empiecen a generar nuevos órganos y tejidos. Debe tenerse precaución para que el tejido no sea
El material genético se encuentra en el núcleo para protegerlo de la degradaciónenzimática. Ese material realiza un proceso de REPLICACIÓN con ayuda de unas enzimas, pero la replicación no se presenta en todo momento, solo cuando la célula va a entrara en proceso de división. Como el material genético no puede salir del núcleo se da una TRANSCRIPCIÓN para que inicie la expresión de los genes, al final de este proceso se obtiene ARNm el cual sale por el poro ayudado de las exportinas. Una vez el ARNm esta en el citoplasma debe ser leído, se da entonces la TRADUCCIÓN , es decir, pasa del lenguaje de nucleótidos al lenguaje de AA, en este proceso participan los ribosomas, el ARNt, los factores de transcripción, GTP, AA. Al finalizar se obtienen proteínas , ellas se expresan en diferentes puntos de la célula para que haya un buen funcionamiento sistémico. Cuando este proceso se altera, pueden resultar proteínas mal formadas que pueden desencadenar enfermedades genéticas.
Existen 2 tipos de enfermedades:
*** Genómica estructural:** Estudio de la estructura del ADN. Lo que hace diferente a una célula de otra son los genes que se expresan. *** Transcriptomica:** Estudia los genes que se expresan en una célula y bajo que condiciones lo hacen. *** Proteomica:** Estudia la estructura de la proteína dentro de la célula y su ubicación. *** Metabolomica:** Estudia la interacción de una proteína determinada con otro tipo de proteínas, en que cascadas de señalización esta presente, donde se ubica, etc. Estudia el metabolismo general de la célula.
MODIFICACIONES POSTERIORES
Virus: Parásitos intracelulares obligatorios. Cuando se encuentran en el ambiente están formados por ácidos nucleicos y proteínas, pero cuando infectan una célula utilizan la misma maquinaria celular para poderse replicar y expresar sus genes. Los virus pueden tener material genético:
- ADN: Unos pocos lo tienen. Puede ser de cadena sencilla o doble.
- ARN: La mayoría lo tienen. Puede ser de cadena sencilla o doble.
- Ambos: Mimivirus (Tienen los dos tipos de material genético, son muy grandes y tienen la capacidad de modificar algunos ARNt).
Si se miran las características generales, el ADN es mucho mas estable que el ARN. El ARN no se puede extraer porque se degrada fácilmente ya que en el ambiente hay muchas ARNasas.
Los virus que tienen material ARN al ser inestables tienen que tener una estrategia para volverse estables, para ello convierten su material genético en ADN. Para poder hacer este proceso, dentro de su genoma los virus tienen la enzima transcriptasa reversa con la cual generan una copia de ARN y devuelven el proceso. Todo esto lo hacen utilizando la maquinaria celular. El virus replica su material genético para que dentro de la capside quede la copia y pueden formarse nuevos viriones que salgan a infectar.
CONCEPTOS
Tecnología del ADN recombinante: Tecnología que involucra la manifestación de secuencias de ADN y la construcción de moléculas quiméricas. Se pueden unir dos moléculas de diferente naturaleza. Clonación del ADN: Introducción de una sección del ADN a un genoma en el cual puede ser reproducida muchas veces. Obtención de múltiples copias de un mismo fragmento. Clon: Colección de moléculas idénticas.
Ejemplos:
- Producción de medicamentos como la insulina ; hoy en día se llama insulina recombinante ya que se obtiene a partir de la bacteria Echerichia coli. Antiguamente la insulina se obtenía del páncreas de los cerdos, pero se necesitaba de muchos cerdos. Lo que se hizo fue clonar el gen de la insulina y luego llevarla a E. coli para que se replicara junto con la bacteria, esto permitió que se obtuviera insulina en mayor cantidad y menor tiempo.
- Las vacunas comestibles también son recombinantes; al material genético de ciertas plantas se le adicionaban los antígenos, la idea era que el antígeno se expresara en ese
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Encontradas en gran variedad de células procariotas. Les dicen “tijeras moleculares”. Función biológica: Degradar ADN extraño.
La actividad biológica de las enzimas de restricción es degradar ADN foráneo.
- Se identificaron inicialmente en las bacterias.
- Son un mecanismo de defensa para poder degradar el material genético de los virus cuando infectan. (Los virus pueden infectar cualquier tipo de célula, los virus que infectan bacterias se llaman bacteriofagos ).
** Cuando un virus infecta a una bacteria, el virus se replica, sintetiza nuevos viriones y cuando los viriones van a salir de la célula generan lisis celular. Las bacterias tienen enzimas de restricción como mecanismo de protección para evitar la lisis; cuando el virus ingresa su material genético a la bacteria, las enzimas van a comenzar a cortar ese material genético para que el virus no se pueda replicar.
- Las bacterias tienen un mecanismo de protección contra sus propias enzimas. Una de las diferencias entre una bacteria y una eucariota, es que las bacterias no tienen núcleo para envolver su material genético circular. Las enzimas de restricción están en el mismo citoplasma, sin embargo las enzimas solo atacan el ADN extraño porque el material genético de las bacterias una vez replicado lo metilan. Las enzimas de restricción no cortan material genético metilado.
Características: Endonucleasas: Cortan el material genético en la parte interna. Reconocer secuencias especificas de 4-8 pares de bases en ADN de doble cadena: La secuencia mas pequeña es de 4pb, le sigue 6pb y luego 8pb; es más fácil encontrar en un genoma una secuencia palindromica de 4pb porque es mas corta y hay mas probabilidad de que se repita. Cortan ambas cadenas al mismo tiempo en lugares específicos: Enlaces fosfodiester. Reconocen secuencias palindromicas: Se lee igual en ambos sentidos. Isoesquizomero: Una enzima reconoce una secuencia, pero una secuencia puede ser reconocida por varias enzimas. Cuando una misma secuencia es reconocida por diferentes enzimas, ellas no cortan en el mismo lugar, sino en lugares diferentes. Existen más de 3.200 enzimas de restricción aisladas de diferentes bacterias. Las enzimas de restricción, a nivel de laboratorio, realizan el corte a 37 C. Cada una tiene un tiempo determinado de corte (algunas necesitan de 10 minutos, otras de 1 hora, etc.). Son una estrategia para analizar más fácil el material genético.
Sitios de restricción: Secuencias que son reconocidas por las enzimas. Fragmentos de restricción: Es originado por el corte. Su longitud depende de la cantidad de pares de bases cortadas y sitios de restricción. Frecuencia de corte: La frecuencia está relacionada con el tamaño del fragmento. 4pb: Enzimas que cortan secuencias de 4pb son de alta frecuencia de corte. Porque hay mayor probabilidad de encontrar una secuencia pequeña. 6pb: Enzimas de moderada frecuencia de corte. 8pb: Enzimas de baja frecuencia de corte.
La palabra “restricción” en biología molecular significa “corte”, es decir que las enzimas reconocen un sitio especifico y allí cortan. El corte origina fragmentos de restricción porque se obtuvieron de un corte con una enzima de restricción.
*Las enzimas de restricción después de cortar tienen la capacidad de modificar el material genético adicionándoles metilo (metilación) para que nadie más pueda cortarlo nuevamente.
*Las secuencias circulares deben tener mínimo 2 sitios de restricción para poder ser fragmentadas. Un solo corte las vuelve lineales pero 2 sitios permiten obtener 2 fragmentos de restricción.
Ejemplos de enzimas de restricción: El nombre de cada enzima se relaciona con el organismo del cual se extrae, la cepa y el orden de descubrimiento.
- EcoRI: Proviene de la bacteria Echerichia coli. Es la más común y más utilizada en laboratorios.
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Enzimas tipo III:
- Reconocen secuencias No palindromicas.
- Cortan el material genético 24-26 pb antes o después del sitio.
Tampoco se utilizan en ingeniería por ser inespecíficas.
ENZIMAS TIPO II
Pueden cortar en 2 puntos determinados:
- En extremos
- En el interior Puede originar dos tipos de fragmentos:
- Extremos pegajosos o cohesivos: Ambos fragmentos son iguales, una parte de la cadena queda sin complemento.
- Extremos romos: Quedan como dos pequeñas cadenas, todas las bases quedan con complemento.
Es mas sencillo adicionar otro fragmento de ADN en el extremo pegajoso o cohesivo porque hay bases que no tienen complemento, pero el fragmento que se vaya a unir tiene que ser complementario; es decir que haya sido cortado con la misma enzima de restricción para quede con las mimas bases.
Cuando se unen las dos fragmentos iguales, se origina una molécula recombinante.
CLASE 2 – 1 de Febrero de 2016
Preguntas: CYP: Citocromo Oxidasa. Encargada del metabolismo de medicamentos. Los sistemas de enzimas de restricción son de restricción (corte) y modificación (metilación).
MAPAS DE RESTRICCIÓN
En el se localizan los sitios de restricción para cada enzima especifica. Esto se hace por métodos de bioinformática.
Representación de fragmentos de ADN que muestra los sitios de corte de la endonucleasa de restricción y la distancia en pares de bases. Es decir que en un fragmento de ADN, el mapa de restricción muestra cuales son los puntos específicos donde una enzima determinada realizara el corte y cual es al distancia que queda entre un sitio de restricción y otro. Permite identificar mutaciones puntuales en secuencias especificas del ADN. Si hay una mutación puntual, la secuencia palindromica se pierde y la enzima no podrá cortar. También por una mutación se puede originar una secuencia palindromica accidental, entonces la enzima comenzara a cortar en un sitio donde antes no lo hacia. Con esto podemos determinar polimorfismos.
Los polimorfismos pueden servir para detectar susceptibilidad a enfermedades. La enzima corta específicamente, pero si no hace el corte en el lugar que se supone debe hacerlo, es porque hay una mutación puntual que altera completamente el orden.
Las enzimas de restricción también son utilizadas para identificar marcadores moleculares.
Ejercicio:
En un mapa de restricción, la suma de los fragmentos originados siempre debe ser igual a la molécula inicial.
en un vector de expresión y antes de inducir su expresión lo clonaron y luego en un medio con E. coli indujeron su expresión para obtener múltiples copias de esa proteína.
RECORDAR que la replicación es bidireccional y semidiscontinua porque se hace en doble cadena.
PLÁSMIDOS
- Molécula de ADN circular que se replica a parte del cromosoma bacteriano (extracromosómico). Es decir que no se encuentra dentro del material genético de la bacteria sino aparte del él.
- Su tamaño esta entre 5.000 y 400.000 pb.
- Permite transportar fragmentos de máximo 10 Kb.
- No es indispensable para la viabilidad de la célula, es decir que la información que contienen los plásmidos dentro de su material genético no es necesaria para la supervivencia de esa célula. Por eso una célula puede carecer de plásmidos.
- Puede replicarse hasta 3.000 copias. También se puede encontrar que una sola célula tenga hasta 3.000 plásmidos. Lo que sucede es que cada vez que la célula se replique, los plásmidos utilizan la maquinaria de la célula para replicarse también, pero como su material genético es mas pequeño puede replicarse muchas mas veces que el cromosoma bacteriano.
- Generan características especiales en la bacteria como la resistencia a antibióticos. Si la bacteria no tiene plásmido no hay problema, pero si tiene un plásmido de resistencia, cuando este en un medio con antibiótico va a sobrevivir.
- El plásmido llega a la bacteria, no es generado por ella.
Partes: Origen de replicación: Punto reconocido por las enzimas para iniciar la replicación. Gen de resistencia a antibióticos: Le permiten a la bacteria crecer en un medio que contenga antibióticos. Sitio de clonaje múltiple (Polilinker): Secuencia en la cual se encuentran diferentes sitios de restricción. Allí es donde se puede abrir el plásmido para insertar el fragmento que se quiere transportar. Para abrir un plásmido es necesario de un solo sitio de restricción y se necesita de una enzima de restricción que tenga un solo sitio y que además deje extremos pegajosos para que se haga un proceso de complementariedad con el fragmento, pero hay que recordar que es necesario de la misma enzima tanto para la apertura del plásmido como para el corte del fragmento. Gen de selección: Uno de ellos es el gen LacZ que codifica para la Beta-galactosidasa (enzima que corta el enlace glucosidico de la lactosa para obtener glucosa y galactosa), si este gen no funciona, la lactosa no se puede degradar. En otras palabras, si el gen LacZ no esta modificado se va a expresar y degradara la lactosa, pero si el fragmento ingresa al vector interrumpe la secuencia del gen impidiendo que se exprese.
Importante tener en cuenta:
Cuando se hacen procesos de clonación, el vector puede ingresar a la bacteria pero puede que a ese vector no se le haya pegado el fragmento. Cuando quiero saber si el vector ingreso a la bacteria se mira el gen de resistencia, porque si la bacteria crece en un medio con antibiótico quiere decir que la bacteria tiene el plásmido. Pero cuando quiero saber si el plásmido tiene el fragmento se mira el gen de selección, se identifica por la coloración de las colonias: Azul (-) a la bacteria entro el vector pero sin fragmento, Blanco (+) a la bacteria entro el vector con le fragmento.
CLONACIÓN CELULAR
Se necesita de una célula hospedera para clonar un fragmento.
Esto es un proceso al azar. Puede darse cualquiera de las 3 opciones, pero en el laboratorio se pueden reducir las posibilidades para obtener la que necesitamos: Aumentar la cantidad de fragmento de ADN. Disminuir la cantidad del vector.
Una vez realizada cualquiera de las dos técnicas, la bacteria debe ser llevada a un medio de cultivo a una temperatura determinada (por ejemplo: E. coli crece a 37 C). Para hacer la selección el medio debe tener antibiótico y X-gal (compuesto similar a la lactosa); esto con el fin de observar la expresión del gen de selección y del gen de resistencia a antibióticos.
Utilidad en ingeniería genética para medicina: Clonación de un gen de una bacteria para identificar su diversidad y procedencia. Identificación de un fragmento de un virus que este identificando. Identificación de genes para conocer si tienen mutaciones.
BACTERIÓFAGOS (Lambda) Virus que infectan bacterias. ** En ingeniería genética también se emplean virus vegetales y animales.
- Los mas utilizados son los denominados “Lambda”.
- Permite clonar fragmentos de ADN mas largos. Esto debido a que su genoma es mas grande que el de un plásmido, por lo tanto pueden transportar un fragmento mayor.
- El genoma de este virus es lineal cuando esta en el interior de la capside viral. En los extremos de este genoma lineal se presentan secuencias Cos L y Cos R; ellas son complementarias para que cuando el virus inyecte su material genético a la célula, ese material genético se vuelva circular.
- El ADN se empaqueta en partículas de fago solo cuando tenga un tamaño entre 40. y 50.000 pb.
- Permite transportar hasta 24 Kb.
- Infectan por endocitosis las células humanas, y por transducción las bacteria. A diferencia de los plásmidos, los virus infectan de forma natural a la célula.
Ciclos de los bacteriófagos: El que se de un ciclo u otro depende de las condiciones de la célula. El virus mira si la célula esta en la capacidad de favorecer la replicación de su material genético. Ciclo lisogénico: Cuando las condiciones de la célula no son adecuadas para que se expresen sus genes o para sintetizar sus proteínas, el virus integra su material genético al material genético de la célula y queda en un estado latente para que cuando la célula se replique le haga el favor de replicarlo también. En otras palabras; la célula esta infectada en ese momento pero los genes del virus no se están expresando. Ciclo Lítico: Cuando la célula esta en condiciones apropiadas, el virus en lugar de incorporar su material genético al de la célula, inmediatamente inicia su proceso de expresión de proteínas y replicación de material genético para generar una progenie nueva de virus que producirá lisis celular. Esos nuevos virus se liberan y van a infectar otras células.
** Existen virus que tienen la capacidad de infectar solamente células que están en proceso de división celular porque aprovechan que la célula tiene su maquinaria activa para replicar su material genético. ** Hay otros virus que solamente infectan células que están en estado basal, es decir, que no se están dividiendo. ** Y algunos infectan de ambas maneras. Esto depende del tipo de virus.
CLONACIÓN DEL VIRUS Los virus tienen genes que generan virulencia, o sea genes que causan daño en la célula. Los virus con los que se trabaja en ingeniería genética son virus a los cuales se les han quitado los genes que generan patogenicidad, son virus manipulados. En esa manipulación se les quitan fragmentos de su genoma y en esas regiones se dejan sitios de restricción para que ese genoma sea abierto en ese punto y allí se pueda ubicar el fragmento que se quiere transportar. A estos virus se les dejan los genes que expresan la proteína de la capside.
La forma de determinar si el virus entro o no a la célula es por la muerte celular. Si hay lisis quiere decir que el virus infecto la célula, pero si no la hay es porque el virus no entro.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE BACTERIAS (BAC)
- Plásmidos que permiten insertos muy grandes (100 – 300 Kb). Los fragmentos que se pueden trasportar son mucho mas grandes que los que puede transportar un plásmido o un virus.
- Presentan 1 o 2 copias por bacteria. Porque como el fragmento es tan grande generaría inestabilidad de la bacteria lo cual disminuiría su metabolismo.
- Huésped modificado que permite la introducción de grandes fragmentos de ADN.
- El proceso se hace igual pero por el gran tamaño que tiene el vector para ingresar el fragmento no sirve el choque térmico sino que se necesita electroporacion. De igual forma se hace la selección de las colonias.
Partes: Genes de resistencia.
CLASE MOLECULAR 3 – 3 DE FEBRERO
La desventaja de la técnica de choque térmico es que en los cambios de temperatura, puede que los poros se abran y nunca se cierren.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA (YAC)
- Solamente se pueden introducir por electroporación
- Permite la manipulación de grandes fragmentos de ADN (hasta 2000 kb). Son quienes tienen mayor capacidad para insertar material genético
- Presentan un origen de replicación para levadura, marcadores de selección y secuencias especializadas (centrómeros y telómeros)
- Se puede introducir tanto en eucariotas como en procariotas, entonces si los YAC son Circulares: se pueden introducir en procariotas Lineales: se pueden introducir en eucariotas porque el cromosoma de la célula eucariota es lineal.
- Se propaga como plásmido en bacterias y como molécula lineal en levadura según el objetivo que se tenga
- Deben tener: Un origen de replicación Un centrómero: constituido por heterocromatina constitutiva. Mantiene unidas las cromatides. Su función es servir de sitio de anclaje de microtúbulos para que se separen durante la división celular, para que vayan hacia los polos. Telómeros: protegen el material genético. Son signo de envejecimiento celular porque se acortan con cada división celular. Marcadores de resistencia a antibióticos Sitio de clonaje múltiple: sitio en donde están los sitios de restricción para cortar Sitio de restricción para BAMH1 (enzima)
Si se va a propagar en una célula eucariota (levadura), para poder linealizar una molécula, lo que se hace son cortes en BAHM para que queden los telómeros libres. Y si se va a adicionar en una procariota (bacteria), no se introduce la enzima BAMH. Si se quiere que la proteína de origen eucariota se exprese es mejor clonarla en una levadura porque la levadura tiene toda la maquinaria celular para hacerle las modificaciones postraduccionales a esa proteína, mientras que si la proteína no requiere de modificación postraduccional, se puede clonar en E. coli
COSMIDOS: VECTOR ARTIFICIAL
- Son plásmidos o vectores artificiales que combinan características de plásmidos y fago λ
- Permite clonación de fragmentos más largos (50 kb)
- Tienen: Un origen de replicación Secuencias Cos: provenientes de λ Genes de resistencia a antibióticos
Sitio de clonaje múltiple Sitio de restricción
- Esta molécula se puede meter en la cápside de un virus para que el virus infecte una célula. Para poderse meter en la cápside viral, deben tener sitios de restricción (presentes en cos) para que pueda volverse el material lineal. Una vez infecte la célula, se va a volver circular por complementariedad de los sitios cos. INTRODUCCIÓN DE MOLECULAS RECOMBINANTES A CELULAS HOSPEDERAS Los hospederos más comunes son:
- E. Coli (procariota)
- Sacharomyces cerevisiae (eucariota)
- Pichia pastoris (eucariota)
El ADN se introduce a las bacterias por 3 mecanismos: transformación, transducción y conjugación. LIBRERIAS O BIBLIOTECAS (GENOTECAS) Son colecciones de material genético. Se encuentran principalmente de 2 tipos:
- Bibliotecas genómicas: Representan todo el genoma de un organismo (tiene tanto secuencias codificantes como secuencias no codificantes)
- Biblioteca de cADN: obtenidos a partir de los ARNm (que tienen secuencias codificantes y cola poliA para diferenciarlos de los demás ARN) de un tejido u organismo completo. Aquí se encuentran los genes que se están expresando en un determinado tejido y en ese tejido, no todos los genes se están expresando de la misma manera y en el mismo momento porque se expresan según las necesidades y condiciones de la célula.
No es lo mismo la expresión génica en una célula normal a la expresión en una célula cancerosa. No todos los genes están representados en una colección de ARN porque no todos los genes se expresan de la misma manera. No es lo mismo los genes que se expresan en una célula pulmonar a los genes que se expresan en un hepatocito. Pero si se toma el ADN de una célula pulmonar y el de un hepatocito va a ser el mismo material genético.
Para poder hacer una librería se necesita:
- Vector: puede ser un plásmido o un virus cortados con una enzima de sitio único
- Insertos: son los fragmentos que se llevaran al interior, puede ser ADN o cADN. El material genómico del organismo de interés se fragmenta, ya sea de manera mecánica o enzimática.
- Cepa hospedera: usualmente es E.coli
PARA UNA LIBRERIAS GENÓMICAS…
- Se extrae el material genético de la Célula
- Se fragmenta el material genético porque es demasiado grande
- Se llevan los fragmentos al interior de un plásmido o virus
- Se lleva el plásmido (o vector) con su respectivo fragmento al interior de una célula
